Поствакцинальные маркеры гепатита в

Поствакцинальные маркеры гепатита в

Результаты проведенных лабораторных исследований играют существенную, если не ведущую, роль для подтверждения диагноза вирусного гепатита и установления его этиологии.

Основным диагностическим маркером ВГВ является HBsAg. Определение HBsAg осуществляется методами ИФА, ФИА, МФА, а также мембранным экспресс-методом. Антитела к HBsAg (далее ~ антиHВS) являются маркером, свидетельствующим о ранее перенесенной инфекции либо наличии поствакцинального иммунитета.

В случаях первичного обнаружения HBsAg, анти-НВsАg методами ИЛА или ФИА необходимо проведение конфирматорного теста.

Для выявления HBeAg используются методы ИФА и ФИА, а также мембранный экспресс-метод. Первично-положительные по HВеАg результаты исследования подтверждаются конфирматорным тестом. HBeAg представляет собой диагностический маркер, ассоцированный с высокой инфекционностью крови, активной репродукцией вируса гепатита В и риском перинатальной передачи возбудителя.

Выявление антител к HBeAg свидетельствует о завершении активной репродукции вирусных частиц и начале стадии реконвалесценции (за исключением мутантных форм вируса).

Для выявления HBcAg применяется преимущественно МФА. Наличие HBcAg в гепатоцитах свидетельствует об активной репродукции вирусных частиц.

Антитела к HBcAg класса М (далее ~ анти-НВс IgM) появляются через 1 — 2 недели после появления HBsAg и циркулируют крови от 2 до 18 месяцев у пациентов с острым вирусным гепатитом В и пациентов с хроническим вирусным гепатитом В — при реактивации инфекции.

Суммарные антитела к HBcAg и составляющие их антитела класса G появляются после анти-НВс IgM и длительно (часто пожизненно) определяются у переболевших острым вирусным гепатитом В, пациентов с хронической формой заболевания.

Качественное определение ДНК вируса гепатита В методом ПЦР указывает на наличие и репродукцию в организме возбудителя.

Количественное обнаружение ДНК вируса гепатита В методом ПЦР (определение вирусной нагрузки) позволяет оценить активность репликации вируса и эффективность противовирусной терапии. Метод IЦР используется также для определения генотипов вируса гепатита В целью выбора оптимальной схемы лечения заболевания.

Специфическая лабораторная диагностика маркеров ВГD проводится у лиц, имеющих маркеры вируса гепатита В.[14]

Выявление серологических маркеров вирусных гепатитов

Установить вирусную природу гепатита и получить информацию об его этиологии возможно только путем выявления серологических маркеров вирусов гепатита. К таким маркерам относят вирусные белки (антигены), специфичные антитела, вырабатываемые организмом в ответ на инфекцию, и нуклеиновые кислоты вируса (ДНК или РНК), представляющие его геном.

Совокупность методов, позволяющих выявлять в биологических тканях и жидкостях специфические вирусные или бактериальные белки (антигены) или антитела, вырабатываемые в организме хозяина в присутствии того или иного возбудителя, относят к иммунологическим методам лабораторного анализа. За последние несколько десятилетий иммунологические методы исследования получили повсеместное распространение. Причиной этого явилось тесное слияние иммунологии и биотехнологии, которое позволило разработать и внедрить в практику широкий спектр тест-систем, основанных на взаимодействии антиген — антитело. Применительно к вирусным гепатитам, иммуноферментный анализ относится к непрямым методам обнаружения возбудителя, позволяющим установить этиологию болезни.

Сравнительно недавно в практику клинико-диагностических лабораторий вошли методы генодиагностики, позволяющие обнаруживать и характеризовать гены или несмысловые последовательности ДНК и/или РНК. Своим развитием эти методы обязаны разработкой в 1983 г принципа полимеразной цепной реакции (ПЦР). Первые сообщения по практическому применению ПЦР появились в 1985 г и с тех пор количество публикаций, где ПЦР используется в качестве одного из методов исследования, занимает одно из первых мест в мировой научной литературе. Эти подходы приложимы для обнаружения и исследования геномов инфекционных агентов, обнаружения маркеров онкологических заболеваний, выявления генетических изменений в геноме человека, связанных с теми или иными функциональными нарушениями. В отличие от ИФА, ПЦР-анализ относится к прямым методам обнаружения возбудителя в клиническом материале, что позволяет оценить активность вирусного процесса и проследить процессы распространения возбудителя в различных органах и тканях.

Серодиагностика вирусного гепатита В.

Вирус гепатита В (hepatitis B virus, HBV) относится к семейству Hepadnoviridae. Геном вируса представлен частично сдвоенной кольцевой молекулой ДНК размером 3200 п.н. При световой микроскопии HBV выглядит сферической частицей диаметром 42 нм (частица Дейна), состоящей из ядра — нуклеоида, имеющего форму икосаэдра диаметром 28 нм, внутри которого находится двуцепочечная ДНК, концевой белок и фермент ДНК-полимераза. В состав нуклеоидного белка входят HBcAg и HBeAg. Внешняя оболочка (толщиной 7 нм) образована поверхностным антигеном HBV — HBsAg (рис. 2, 3). Вирус гепатита В является псевдоретровирусом, т. е. его ДНК может частично встраиваться в геном гепатоцитов. При ОВГ и обострении ХГ вирусные частицы можно обнаружить в гепатоцитах и сыворотке крови больного. При интегративной форме ХГ В и в стадии ремиссии HBV в сыворотке крови не выявляется.Основой лабораторной диагностики инфекции HBV является определение серологических маркеров инфицирования вирусом: HBsAg, HВeAg, анти-НВс класса IgM и IgG, анти-НВе и анти-HBs, HBV ДНК и активности вирусной ДНК — полимеразы. В зависимости от течения вирусного гепатита В спектр изменения серологических маркеров выглядит по-разному

HBsAg — основной маркер инфицирования HBV. При остром вирусном Вв большинстве случаев (90-80 %) HBsAg удается выявить в инкубационном периоде, начиная с 3-5-й недели заражения. Средняя продолжительность циркуляции антигена — 70-80 дней. Быстрое исчезновение HBsAg (в первые дни желтухи) с появлением антиНВs — плохой прогностический признак. При хроническом гепатите ВHBsAg может циркулировать в крови больного на протяжении многих лет. Следует отметить, что применяющиеся в настоящее время методы определения HBsAg, в том числе ИФА, имеют порог чувствительности. Поэтому при наличии клинических признаков гепатита и отсутствии HBsAg в сыворотке крови необходимо исследовать другие маркеры инфекции HBV. Наличие HBsAg в крови свидетельствует о присутствии вируса в печени и с большой долей вероятности в крови. Не всякая сыворотка, содержащая HВsAg, содержит вирус гепатита В. В ряде случаев ДНК вируса встраивается в ДНК гепатоцита не полностью, а частично, только тем участком, который кодирует синтез HBsAg. В этих случаях синтезируются HBsAg без других компонентов вириона, (то есть без других антигенов). Считают, что такая ситуация возникает при «здоровом» носительстве HBsAg.HBeAg вируса гепатита В характеризует высокую инфекционность крови, являясь показателем активной репликации HBV. HBeAg циркулирует в крови больного только в присутствии HBsAg. В первую неделю желтушного периода он выявляется у 85-95 % больных. Выявление HBeAg в течение двух и более месяцев служит прогностическим признаком развития хронического гепатита. У большинства больных хроническим гепатитом с высокой активностью процесса HBeAg сохраняется на длительный срок (до нескольких лет).Антитела к ядерному антигену вируса гепатита В класса M (анти-НВcIgM) — маркер активной репликации НВV и острой инфекции. Выявляются через 1-2 недели после обнаружения HBsAg и сохраняются на протяжении 2-18 месяцев. У 4-20 % больных острым гепатитом В анти-HBcIgM являются единственным маркером инфекции. При ХГ В анти-НВсIgM могут быть выявлены у некоторых больных в меньших титрах, чем при острой инфекции, причем титр антител отражает тяжесть гепатита. Антитела к HBcAg класса G (анти-НВсIgG) появляются практически одновременно с анти-НВсIgM. Как првило, они остаются у всех лиц, переболевших гепатитом В, пожизненно. У 95 % носителей HBsAg наряду с HBsAg циркулируют и анти-НВсIgG. Антитела к HBsAg (анти-НВs) свидетельствуют о ранее перенесенной инфекции или о наличии поствакцинального иммунитета (защитный уровень — 10 МЕ/мл). Они появляются в период выздоровления, через 4 недели после исчезновения HBsAg, достигая максимальной концентрации через 1-2 года, с последующим постепенным снижением уровня, недоступного выявлению современными методами диагностики. В некоторых случаях анти-HВs могут циркулировать пожизненно. Появление анти-HBs на фоне клинического улучшения у больного гепатитом В является хорошим прогностическим признаком. Важно отметить, что в динамике острой инфекции HBV имеется «окно», когда HBsAg уже не определяется, а анти-HBs еще не появились. При этом выявляются анти-HBcIgM и IgG. Из этого следует вывод о необходимости обследования больных ОВГ на анти-HBcIgM даже при отрицательных результатах исследования HBsAg и анти-НВs. Антитела к HBeAg (анти-НВе) появляются в крови после элиминации HBeAg и завершения репликации вируса. К концу 9-й недели острого периода гепатита В более 90 % больных имеют анти-НВе. В период выздоровления анти-НВе могут исчезать. Однако, наличие анти-НВе не является показателем отсутствия инфекционности конкретной сыворотки крови. Показано, что у ряда больных в ходе развития гепатита В (около 10%) под влиянием «иммунного давления» на вирус возникают мутантные формы, которые «избегают» иммунного надзора и не элиминируются. У носителей анти-HBe был выделен мутант, неспособный продуцировать HBeAg из-за дефектов в области precore и получивший обозначение HBeAg-отрицательного. Появление HBeAg-отрицательного мутанта приводит к прогрессированию поражения печени при продолжающейся репликации вируса (наличие ДНК HBV в сыворотке крови). При первичном инфицировании HBeAg-отрицательным мутантом существенно возрастает риск развития фульминантного гепатита. Описанные маркеры гепатита В исследуются методом ИФА. Спектр антител (анти-НВе, анти-НВs, анти-НВcIgM, анти-НВcIgG) и антигенов (HBsAg, HBeAg) позволяет установить диагноз гепатита В и определить стадию заболевания (таблица 1). Недостатком данного метода является невозможность его использования при заражении мутантными формами вируса, при иммуносупрессии (больные онкологическими заболеваниями, наркоманы и т.д.) и для количественной оценки присутствующего в организме возбудителя. Решение этих задач стало возможным в результате внедрения молекулярно-биологических методов в практику клинико-диагностических лабораторий.

Таблица 1. Различные сочетания серологических маркеров инфицирования вирусом гепатита В и их интерпретация

HBsAg

HBeAg

антиНВc IgM

антиНВ c сумм

антиНВе

антиНВs

HBV ДНК

Трактовка результата

+

+

+

+

+

Острый гепатит В. Дикий штамм

+

+

+

+

Острый гепатит В. Мутантный штамм

+

+/-

+

+

-/+

Разрешившийся острый гепатит В.Сероконверсия.

+

+

+/-

+

-/+

+

Хронический активный гепатит В

+/-

-/+

-/+

+

+/-

+/-

Хронический интегративный гепатит В

+

+

-/+

«Здоровое» носительство

+

-/+

+

Перенесенный вирусный гепатит В

+

Состояние после иммунизации

Методы генодиагностики, к которым относится ПЦР, существенно расширяют возможности лабораторной диагностики вирусного В, позволяя непосредственно выявить возбудитель, установить тканевую и внутриклеточную локализацию HBV, выявить и охарактеризовать мутантные формы вируса, оценить уровень виремии в течение заболевания, в том числе — на фоне противовирусной терапии.

В настоящее время существует широкий спектр диагностических тест-систем для выявления ДНК HBV в лабораторных условиях, основанных на методах ПЦР — фирмы «Roche», НПФ «Литех», «ДНК технология», LCR (лигазная цепная реакция) — фирма «Abbott», bDNA (метод «развлетвленных» ДНК зондов) — фирма «Chiron». Эти тест-системы позволяют проводить качественное определение наличия возбудителя в биологическом материале: сыворотке или плазме крови, ткани печени, мононуклеарах. Одним из вариантов качественного определения ДНК HBV является технология ПЦР insitu (в гистологических срезах), позволяющая установить внутриклеточную локализацию вируса в гепатоцитах.

Единственная коммерческая тест-система дифференциальной диагностики НВеAg-отрицательного гепатита В создана фирмой «Abbot» с использованием LCR. Существенным недостатком этой системы является выявление только одной из многих мутаций, приводящих к отсутствию синтеза НВеAg вирусом. Выявление всей совокупности генетических изменений, характерных для НВеAg-отрицательных вирусов гепатита В, возможно пока только прямым секвенированием ПЦР-амплифицированных фрагментов вирусного генома.

Количественная характеристика содержания ДНК HBV в клинических образцах важна для оценки эффективности противовирусной терапии и имеет прогностическое значение для определения хронизации HBV. При исходно низком уровне виремии (ДНК HBV менее 500 фг/мкл) процент хронизации острого гепатита В близок к нулю, при концентрации HBV ДНК от 500 до 2000 фг/мклхронизация процесса наблюдается у 25-30% больных, а при высоком уровне виремии у пациента (более 2000 фг/мкл) острый гепатит В чаще всего переходит в хронический.

Известные коммерческие тест-системы оценки концентрации ДНК HBV реализуют принцип конкурентного ПЦР-анализа с последующей гибридизационной схемой определения продуктов амплификации (фирма «Roche», НПФ «Литех»). Этот подход основан на внесении в клинический образец внутреннего стандарта известной концентрации, качественно отличающегося от определяемой матрицы. После ПЦР концентрация ДНК HBV в исследуемом материале рассчитывается на основании известной концентрации внутреннего стандарта и соотношения накопления продуктов амплификации внутреннего стандарта и определяемой матрицы.

В настоящий момент развитие методов лабораторной диагностики гепатита В идет по направлению создания коммерческих тест-систем для идентификации клинически значимых мутантных штаммов HBV, а также использованию новых оптических приборов (биосенсоров) для комплексной диагностики инфекции HBV (вирусных белков, антител к ним и ДНК HBV)

Серодиагностика гепатита С

Вирус гепатита С (hepatitis C virus, HCV) является РНК содержащим гепатотропным и лимфотропным вирусом, относящимся к семейству Flaviviridae. Геном вируса представлен одноцепочечной молекулой (+) РНК размером около 9500 оснований, кодирующей структурные и неструктурные белки.К структурным белкам относят белок сердцевины (кор) и гликопротеины оболочки (Е1 и Е2). Неструктурную область представляет комплекс белков с ферментативной активностью, в первую очередь РНК-зависимая — РНК полимераза. Помимо вирусных белков, снаружи вирион покрыт липидной оболочкой состоящей из липопротеинов организма хозяина низкой плотности. До 1990 г. ХГ ни-А-ни-В с парентеральным путем передачи диагностировали на основании повышенной активности АЛТ сыворотки в течение 6 месяцев, при отсутствии других известных маркеров вирусных гепатитов. Однако у части больных ХГ С уровень АЛТ не повышается. В современной диагностике гепатита С основная роль отводится определению антител к HCV и выявлению РНК HCV.

В отличие от гепатита В, при котором могут быть определены антигены вируса и антитела к ним, при гепатите С методом ИФА улавливаются только антитела. Антигены HCV, если и попадают в кровь, то в количествах, которые практически не улавливаются. Они могут быть обнаружены только в ткани печени при использовании иммунногистохимических методов исследования. Это существенно ограничивает возможность оценки течения и активности инфекционного процесса.

Анти-HCV не свидетельствуют о продолжающейся репликации вируса, и могут являться признаком как текущей, так и перенесенной инфекции. Приходится также учитывать, что у реципиентов, которым была перелита инфицированная кровь, могут обнаруживаться анти-HCV донора, не обязательно свидетельствующие о заражении HCV. У больных ХГ С анти-HCV обнаруживаются в крови не только в свободной форме, но и в составе циркулирующих иммунных комплексов. Антитела образуются к каждому из вирусных белков, расположенных в структурной и неструктурной области вирусного генома. Этим определяется их различная специфичность и, соответственно, разная диагностическая информативность. Для скрининга гепатита С используют метод ИФА, а в качестве подтверждающего теста — метод иммунноблота (RIBA). Существует несколько поколений диагностических тест-систем для выявления анти-HCV, отличающихся своей чувствительностью и специфичностью (таблица 2).

Таблица 2. Сравнение разных поколений диагностических иммуноферментных тест-систем для выявления антител к ВГС.

Тест-система

Шифр фрагментов

Белок, содержащий данный фрагмент

Эффективность

1 поколение

С100-3

NS3 и NS4

до 82,2%

2 поколение

С100-3, С22, С33с

NS4, кор, NS3

до 97,5%

3 поколение

С100-3, С22, С33с, NS5

NS4, кор, NS3, NS5

до 99,7%

4 поколение*

С100-3, С22, С33с, NS5

NS4, кор, NS3, NS5

до 99,7%

RIBA-3

С100-3, С22, С33с, NS5, e1, e2

NS4, кор, NS3, NS5, E1, E2

до 99,6%

*Тест-системы 4-го поколения содержат синтетические и рекомбинантные вирусные антигены, размеры которых могут отличаться от фрагментов 3-го поколения.

В заключении следует упомянуть о необходимости комплексного обследования больного с привлечением новейших достижений медицинской и биологической науки для правильной диагностики вирусных гепатитов и назначения адекватной терапии больному.[2,4,7,21]

Биохимический анализ крови

Биохимический анализ крови пациентов давно вошел в практику клинических лабораторий. Совокупность получаемых данных о показателях обмена биллирубина, сывороточных белках и ферментах позволяют обнаружить воспалительные процессы, происходящие в организме человека и предположить их локализацию. Эти критерии не специфичны и не характеризуют этиологию вирусных гепатитов, вместе с тем существенны для оценки функционального состояния печени.

Показатели обмена билирубина.

Оценить у пациента состояние обмена билирубина можно на основании биохимического анализа крови, мочи и кала. Свободный билирубин является производной гемоглобина, высвобождающегося в процессе гемолиза эритроцитов. В физиологических условиях каждые сутки гемолизируется примерно 1% циркулирующих эритроцитов, из которых образуется 200-250 мг билирубина. Основная часть билирубина поступает в кровяное русло из клеток системы мононуклеарных фагоцитов селезенки и костного мозга. Билирубин нерастворим в воде, поэтому в крови его перенос осуществляют неспецифические транспортные белки — альбумины. Свободный билирубин является токсичным соединением, способным проникать через гемато-энцефалический барьер, вызывая энцефалопатии. Детоксикация билирубина происходит в клетках печени, где к нему присоединяется глюкуроновая кислота, образуя глюкурониды билирубина. Эти соединения уже не токсичны и водорастворимы, что облегчает их выведение из организма в составе желчи. В кишечнике под действием бактериальных ферментов образуются две группы продуктов распада билирубина — уробилиногены и стеркобилиногены, основная часть которых выводится с калом. В нормальных физиологических условиях почки в выведении билирубина не участвуют. Билирубин в крови здорового человека содержится в концентрации 1,7 — 17,1 мкмоль/л и представлен двумя фракциями: нерастворимый билирубин, связанный с альбумином — непрямой билирубин, и растворимые глюкорониды билирубина — прямой билирубин. В норме их соотношение составляет 3:1. При гепатитах повреждаются клетки печени и, вследствие этого, снижается продукция желчи. Кроме того, в результате повреждения паренхимы печени желчь поступает не только в желчные канальцы, но и в кровь. Эти процессы приводят к увеличению общего билирубина крови за счет обоих его фракций. Отмечено, что уже в конце преджелтушного периода у части больных на фоне нормального общего билирубина начинает расти фракция прямого билирубина, что является ранним показателем цитолитических процессов в печени. В моче начинают выявляться билирубин и уробилины, а концентрация стеркобилина в кале резко снижается (таблица 3).

Таблица 3. Соотношение показателей обмена билирубина в норме и при развитии печеночной желтухи.

Показатели

Нормальные значения

Печеночная желтуха

Общий билирубин сыворотки крови

1,7 — 17,1 мкмоль/л

Значительное повышение

Прямой билирубин сыворотки крови

до 3,4 мкмоль/л

Повышение

Непрямой билирубин сыворотки крови

1,7 — 12,7мкмоль/л

Повышение

Реакция мочи на билирубин и уробилин

Отрицательная

Положительная

Реакция кала на стеркобилин

Положительная

Отрицательная

Следует отметить, что показатели обмена билирубина для диагностики вирусного гепатита играют роль только при развитии желтухи. Безжелтушная форма и преджелтушная фаза вирусных гепатитов в своем большинстве остаются нераспознанными.

Оценка активности ферментов.

Определение активности аминотрансфераз сыворотки (аланинаминотрансферазы (АЛТ) и аспартатаминотрансферазы (АСТ)) является высокочувствительным показателем цитолиза гепатоцитов, что определяет ее ведущую роль в диагностике гепатитов различной этиологии. При цитолитическом процессе, развивающимся в печени больного вирусным гепатитом, преобладает «вымывание» АЛТ, степень повышения АСТ существенно меньше (таблица 4).

Таблица 4. Определение активности ферментов в сыворотке крови

Фермент

Нормальные* значения

Значения при гепатитах

Специфичность для гепатоцитов

Аланинаминотрансфераза (АлАТ)

до 40 Ед/л

увеличение

Аспартатаминотрансфераза (АсАТ)

до 40 Ед/л

увеличение

Сорбитдегидрогеназа (СДГ)

до 17 Ед/л

увеличение

+

Фруктозо-1-фосфатальдолаза (Ф1ФА)

до 1 ЕД

увеличение

+

Урокиназа

до 1ЕД

увеличение

+

Щелочная фосфатаза (ШФ)

31-115 Ед/л дети: до 350 Е/л

увеличение

* значения приведены в соответствии с рекомендациями диагностических тест-систем, используемых в КДЛ НПФ «Литех»

Для дополнительного подтверждения гепатогенной природы ферментемии можно определить активность печеночно-специфических ферментов — сорбитдегидрогеназы, фруктозо-1-фосфатальдолазы, урокиназы и др. Они локализуются преимущественно в гепатоцитах и их выявление в крови однозначно связано с патологией печени. Вместе с тем, эти тесты уступают по чувствительности определению активности АЛТ. Активность АЛТ и АСТ отражает выраженность воспаления в печени, но не этиологию гепатита.

Белковые пробы

При острых вирусных гепатитах общее содержание белков плазмы крови и их состав практически не изменяются. Исключение представляет тимоловая проба, в норме имеющая значения до 4 ЕД и возрастающая до 6-8 ЕД при гепатитах.

При ХГ на стадии ЦП могут наблюдаться уменьшение концентрации альбумина в сыворотке крови, снижение протромбинового индекса (менее 70%), уменьшение концентрации других факторов свертывания крови в рамках синдрома печеночно-клеточной недостаточности. Дополнительными показателями активности гепатита являются ускорение СОЭ (і15 мм/ч), повышение концентрации гамма-глобулинов сыворотки.[10,16,19]

Определения лактатдегидрогеназы.

Принцип метода:

Модифицированный метод в соответствии с рекомендациями Скандинавского Комитета по Ферментам (СКФ).

ЛДГ

Пируват + НАДН + Н+ ? Лактат + НАД+

Состав набора:

1. Буферный раствор:

ТRIS-буфер (рН 7,4) 50ммоль/л

Пируват 1,5ммоль/л

2. Субстратный раствор:

НАДН 0,8ммоль/л

Подготовка и стабильность реагентов

Метод работы с индивидуальными реагентами. Реагенты готовы к применению. Реагенты, даже после вскрытия флаконов, могут сохраняться при 2-8 С до указанного срока годности. Буферный раствор необходимо хранить в защищённом от света месте. Следует избегать загрязнения реагентов!

Метод работы с рабочим реагентом. Для приготовления рабочего реагента следует: Осторожно — смешать реагент 1 (Буферный раствор) и 2 (Субстрат) в соотношении 4:1 Рабочий реагент можно хранить в течение 3 недель при 2-80С или 3 дня — при 15-25С. Рабочий реагент следует хранить в защищённом от света месте.

Исследуемый материал:

Сыворотка, гепарин- или ЭДТА-плазма.

Не использовать гемолизированные пробы!

Падение активности в течение 3 дней

при 2-8С — 8%, при 15-25°C — 2%.

Схема проведения анализа:

Длина волны: Hg 334 им, 340 нм, Hg 365 нм

Длина оптического пути: 1 см

Температура: 25С, 30С или 37С

Измерение: относительно воздуха (уменьшение поглощения). Реагенты и кюветы прогреть до необходимой температуры. Температуру в течение анализа поддерживать постоянной (±О.5С).

Схема пипетирования *

Таблица 5 Метод работы с индивидуальными реагентами

В кюветы пипетировать

25С, 30С

37С

Проба

20мкл

10мкл

Буферный раствор

1000мкл

1000мкл

Перемешать, инкубировать 1-5 минут при необходимой температуре

Субстрат

250мкл

250мкл

Перемешать, через 1минуту измерить поглощение и одновременно включить секундомер. Точно через 1,2,3 мин повторить измерение.

Таблица 6 Метод работы с рабочим реагентом

В кюветы пипетировать

25С, 30С

37С

Проба

20мкл

10мкл

Рабочий раствор

1000мкл

1000мкл

Перемешать, через 1минуту измерить поглощение и одновременно включить секундомер. Точно через 1,2,3 мин повторить измерение.

* При использовании микрокювет объемы можно уменьшить вдвое

Расчёт

Рассчитать среднюю величину изменения поглощения в минуту (*А/мин) и её подставить в формулу:

Активность ЛДГ (Ед/л) = *А/мнн Х F Применять следующие факторы:

Таблица 7 Метод работы с индивидуальными реагентами:

Значение фактора F

Hg334нм

340нм

Hg 365нм

F(25С, 30С)

10275

10080

18675

F (37С)

20390

2000

37060

Таблица 8 Метод работы с рабочим реагентом:

Значение фактора F

Hg334нм

340нм

Hg 365нм

F(25С, 30С)

8250

8095

15000

F (37С)

16345

16030

29705

Фактор пересчета результатов, выраженных в традиционной системе единиц (Ед/л), в Международную систему единиц (кат/л):

1 Ед/л =16,67х10-3 мккат/л, 1 мккат/л=60 Ед/.

Эксплуатационная характеристика

Линейность: Если изменение адсорбции в минуту составляет *A/min=0,150 при Hg 334 нм, 340 нм или 0,070 при Hg 365 нм, необходимо 100 мкл пробы смешать с 900 мкл физ. раствора (0,9% NaCl) и повторить определение. Полученный результат умножить на 10.

Таблица 9 Диапазон референтных величин

Температура

25С,Ед/л

30С,Ед/л

37С,Ед/л

Взрослые

120-140

160-320

225-450

Дети (до года)

До 500

Определения аланинаминотрансферазы

Кинетический метод.

Кат №~ 001.017.01 Ферментный реагент 1* 80мл

Субстратный раствор 1*20мл

Kaт №~ 001.017.10 Ферментный реагент 1* 800мл

Субстратный раствор 2*100мл

Kaт № 001.017.11 Ферментный реагент 4* 80мл

Субстратный раствор 2*40мл

Принцип метода

Модифицированный, оптимизированный кинетический метод в соответствии с рекомендациями Международной Федерации Клинической Химии (IFCC), без активации пиридоксальфосфатом:

АЛАТ

2-0ксоглутарат + L-Аланин ~ L-Глутамат + Пируват

ЛДГ

Пируват + НАДН +Н+ —- L -Лактат + НАД+

Состав набора

1. Ферментный реагент:

ТРИС-буфер (рН 7,5) 150 ммоль/л

L -Алании 750 ммоль/л

ЛДГ ?1,2 кЕд/л

2. Субстратный раствор:

2-0ксоглугарат 90 ммоль/л

НАДН 0,9 ммоль/л

Подготовка и стабильность реагентов

При работе с индивидуальными реагентами: Реагенты готовы к использованию и устойчивы, даже после вскрытия флаконов, до указанного срока годности при хранении при-2 — 8 С в защищенном от света месте. Следует избегать загрязнения реагентов.

При работе с рабочим реагентом для приготовления рабочего реагента следует:

Осторожно смешать реагент 1 (Ферментный) и 2 (Субстрат) в соотношении 4:1 Рабочий реагент можно хранить в течение 4-х недель при 2-80С и 5 дней при 15-250С.

Исследуемый материал:

Сыворотка, ЭДТА- или гепарин-плазма. Гемолиз мешает проведению анализа! Потеря активности в течение 3 дней при 4°С: <10%, при 20-250С: <17%

Схема проведения анализа

Длина волны: 340нм или Hg 334 нм, 365 нм

длина оптического пути: 1 см

Температура измерения: 25°С, 30°С, 37С

Измерение: против воздуха (снижение поглощения). Перед измерением реагенты и кюветы прогреть до необходимой температуры и в течение измерения Поддерживать температуру постоянной

(± 0,50С).

Схема пипетирования*

Таблица 10 Метод работы с индивидуальными реагентами

В кюветы пипетировать

25С, 30С

37С

Проба

200мкл

100мкл

Ферментный реагент

1000мкл

1000мкл

Перемешать, инкубировать 5 минут при необходимой температуре

Субстрат

250мкл

250мкл

Перемешать, через 1минуту измерить поглощение и одновременно включить секундомер. Точно через 1,2,3 мин повторить измерение.

Таблица 11 Метод работы с рабочим реагентом

В кюветы пипетировать

25С, 30С

37С

Проба

200мкл

100мкл

Рабочий раствор

1000мкл

1000мкл

Перемешать, через 1минуту измерить поглощение и одновременно включить секундомер. Точно через 1,2,3 мин повторить измерение.

*Полумикрометод; для макрометода объемы удвоить

Расчет

Рассчитать среднюю величину изменения поглощения за 1минуту (А/мин) и использовать ее в расчете:

Активность АлаТ (ед/л) = А/мин х

При изменении поглощения в минуту (А/мин) 0,06-0,08 (Hg 365нм) или 0,12-0,16 (Hg 334нм и 340нм) следует принимать во внимание результаты измерения только в первые 2 минуты (1 мин инкубировать и 2мин измерять). Применять следующие значения фактора F/

Таблица 12 Метод работы с индивидуальными реагентами:

Значение фактора F

Hg334нм

340нм

Hg 365нм

F(25С, 30С)

1173

1151

2132

F (37С)

2184

2143

3971

Таблица 13 Метод работы с рабочим реагентом:

Значение фактора F

Hg334нм

340нм

Hg 365нм

F(25С, 30С)

971

952

1765

F (37С)

1780

1745

3235

Фактор пересчета результатов, выраженных в традиционной системе единиц (Ед/л), в Международную систему единиц (кат/л):

1Ед/л = 16,67 х 10-3 мккат/л

1 мккат/л = 60 Ед/л

Таблица 14 Эксплуатационная характеристика

А/мин

25С, 30С

37С

Hg 365нм

0,080

170 Ед/л

320 Ед/л

Hg334нм/340нм

0,160

190Ед/л

350Ед/л

При такой активности /поглощении или выше необходимо 0.1 мл пробы смешать с 0,9 мл раствора NaCl (0,9%) и повторить определение, а результат умножить на 10. Высокоактивные сыворотки могут показывать очени низкие величины начального поглощения, так как большая часть НАДН будет израсходована до начала измерения. В этом случае необходимо провести разведения, как описано выше.

Таблица 15 Диапазон референтных величин

25С

30С

37С

Мужчины

До 22 Ед/л

До 30 Ед/л

До 42 ЕД/л

Женщины

До 17 Ед/л

До 23 Ед/л

До 32 Ед/л

Контроль качества

Допускается использование контрольных сывороток, активность АлаТ в которых определена (аттестована) данным методом.

Примечание

Ферментный реагент и субстрат содержат азид натрия (0,095%). Следует избегать их контакта с кожей и слизистыми оболочками!

определение аспартатаминотрансферазы

кинетический метод

Принцип метода: основан на последовательности ферментативных реакций:

L — аспартат+ 2 — оксоглутарат АЛТ ~ глутамат + оксалоацетат оксалоацетат + НАДН+ Н лдг ~ лактат + НАД +

Скорость уменьшения концентрации НАДН, который имеет максимум поглощения при 340 нм, пропорциональна активности АЛТ и измеряется фотометрически.

Методика анализа:

Набор реагентов предназначен для ручного определения и для определения на автоматических и полуавтоматических анализаторах.

Ручное определение:

Длина волны 340 им, температура измерений 37 С.

В кювету помещают 500 мкл рабочего реагента, прогревают 5 минут, затем добавляют 50 мкл исследуемого материала и перемешивают.

Инкубируют 1 мин при 37 С, измеряют оптическую плотность раствора по отношению к воздуху или воде. Точно через 2 минуты повторяют измерение, вычисляют среднее изменение оптической плотности за 1 мин. (~А/мин)

Расчет:

Е/л =*A /мин х F, где F = 1770

Нормальные значения: мужчины до 40 Е/Л

Женщины до 40 Е/л [10]

определеиия аланинаминотрансферазы кинетическии метод

Принцип метода:

основан на последовательности ферментативных реакций:

L — аланин + 2 — оксоглутарат АЛТ ~ глутамат + пируват

Пируват + НАДН+ Н лдг ~ лактат + НАД +

Скорость уменьшения концентрации НАДН, который имеет максимум поглощения при 340 нм, пропорциональна активности АЛТ и измеряется фотометрически.

Методика анализа:

Набор реагентов предназначен для ручного определения и для определения на автоматических и полуавтоматических анализаторах.

Ручное определение:

Длина волны 340 нм, температура измерений 37 С .

В кювету помещают 500 мкл рабочего реагента, прогревают 5 минут, затем добавляют 50 мкл исследуемого материала и перемешивают.

Инкубируют 1 мин при 37 С, измеряют оптическую плотность раствора по отношению к воздуху или воде. Точно через 2 минуты повторяют измерение, вычисляют среднее изменение оптичемкой плотности за 1 мин. (*А/мин)

Расчет:

Е/л = *А /мин х F, где F = 1746 Нормальные значения: мужчины до 42 Е/Л Женщины до 32 Е/л

определения щелочной фосфатазы.

Кинетический метод.

KaT,N’g 001.006.01-001 1. Буфер 80мл

2. СУбстрат 20 мл

Кат № 001.006.10-001 1. Буфер 160 мл

2. Субстрат40мл

Принцип метода

Оптимизированный стандартный метод в соответствии с рекомендациями IFCC.

ЩФ п-нитрофенилфосфат+н.о ~ фосфат +п-нитрофенол

Состав набора

1. Буфер:

Буфер АМР (рН 10,4) 435ммоль/л

Магния ацетат 2,5 ммоль/л

2. Субстрат:

п-нитрофенилфосфат 60 ммоль/л

Подготовка и устойчивость реагентов

Метод работы с индивидуальными реагентами. Реагенты готовы к применению. Реагенты, даже после вскрытия флаконов, могут сохраняться при 2-8ОС до указанного срока годности. Следует избегать загрязнения реагентов!

Метод работы с рабочим реагентом.

Для приготовления рабочего реагента следует:

Осторожно смешать реагент 1 (Буферный раствор) и 2 (Субстрат) в соотношении 4: l. Рабочий реагент устойчив 4 недели при 2-80С или; 5 дней при 15·25С. Рабочий реагент следует хранить в защищённом от света месте.

Исследуемый материал

Сыворотка, гепаринизированная плазма. Не использовать гемолизированные пробы!

Падение активности в сыворотке в течение 7 дней: 0% при 4°С, 10% при 20-250с.

Схема проведения анализа

Длина волны: Hg 405 нм (400 — 420 нм)

Длина оптического пути: 1 см Температура: 30ОС, 37°С

Измерение: против воздуха (увеличение поглощения).

Реагенты и кюветы прогреть до необходимой температуры. Температуру в течение анализа поддерживать постоянной (±0.5С).

Таблица 16 Схема пипетирования*

В кюветы пипетировать

25С, 30С 37С

Проба

20мкл

Буферный раствор

1000мкл

Перемешать, инкубировать 1 минут при необходимой температуре

Субстрат

250мкл

Перемешать, через 1минуту измерить поглощение и одновременно включить секундомер. Точно через 1,2,3 мин повторить измерение.

Таблица 17 Метод работы с рабочим реагентом

В кюветы пипетировать

25С, 30С 37С

Проба

20мкл

Рабочий раствор

1000мкл

Перемешать, через 1минуту измерить поглощение и одновременно включить секундомер. Точно через 1,2,3 мин повторить измерение.

* При использовании микрокювет объемы можно уменьшить вдвое

Расчёт активности

Рассчитать среднюю величину изменения поглощения за 1 минуту (*А/мин) и подставить её в формулу расчёта активности. Активность щелочной фосфатазы рассчитывается по следующим формулам:

* метод работы с индивидуальными реагентами,

Активность ЩФ (Ел/л) = А/мин х 3433

* метод работы с рабочим реагентом:

Активность ЩФ (ЕД/л) = М/мин х 2757

Фактор пересчёта результатов, выраженных в традиционной системе единиц (Ед/л), в Международную систему единиц (кат/л):

1 Ед!л = 16,67 х 10-3 мккат/л, 1 мккат/л = 60 Ед/л

Характеристика метода

Линейность: до 700 Ед/л

При такой и более высокой активности необходимо 100 мкл пробы смешать с 500 мкл физ.раствора (0,9% NaCl) и повторить определение. Результат умножить на 6.

Таблица 18 Нормальные показатели

Температура

30С,ед/л

37С,ед/л

IFCC

Женщины

28-78

42-98

35-104

Мужщины

38-94

53-123

40-129

Контроль качества

Допускается использование контрольных сывороток, активность Щелочной Фосфатазы в которых определена (аттестована) данным методом.

Автоматизация

Программы адаптации для автоматических и полуавтоматических клинико-химических анализаторов поставляем по заказу.

Примечание

Реагенты содержат азид натрия (0,095%). В реакционной смеси содержится п-нитрофенол. Это вещество ядовито! Следует избегать вдыхания, контакта с кожей и слизистыми оболочками! При контакте с кожей необходимо немедленно промыть её большим количеством воды. [10]

Определения концентрации общего и прямого билирубина в сыворотке крови

Предназначение набор реагентов для определения концентрации общего и прямого билирубина в сыворотке крови колориметрическим методом (метод Йендрашека-Грофа, method Jendrassik-Grof) на биохимических или автоматических анализаторах.

Принцип метода: Общий билирубин определяется на основе реакции с диазотированной сульфаниловой кислотой, после диссоциации не конъюгированного (непрямого, свободного) билирубина при участии кофеинового реагента. Для определения содержания конъюгированного (прямого, связанного) билирубина из реакционной смеси исключается кофеиновый реагент. Концентрация не конъюгированного билирубина рассчитывается по разнице концентрации между общим и конъюгированным билирубином .

Исследуемый материал

Негемолизированная сыворотка крови.

Состав набора

Реагент №1. Кофеиновый реагент;

Реагент №2. Сульфаниловая кислота;

Реагент №3. Натрия нитрит;

Реагент №4. Физиологический раствор;

Калибратор — 85,5 мкмоль/л (при разведении в 2-х мл воды);

171 мкмоль/л (при разведении в 1-ом мл воды)

Аналитические характеристики набора:

Линейность — до 220 мкмоль/л;

Значение коэффициента вариации — не более 5%.

Время проведения анализа — не более 16 мин (общий билирубин), не более 4 мин (прямой билирубин).

Для оценки правильности определений можно использовать контрольные сыворотки, аттестованные данным методом.

Приготовление рабочего реагента и его стабильность:

Флаконы №1,2,3 и 4 содержат готовые к использованию реагенты.

Содержание флакона с калибратором перед использованием растворите в 2мл (1мл) дистиллированной воды. После полного растворения концентрация билирубина — 85,5 мкмоль/л (171 мкмоль/л).

Разведенный реагент стабилен в течение 5 дней при 40С. Сухой реагент стабилен в течение года при комнатной температуре (18-25С).

Реагент светочувствителен! Хранить в защищенном от света месте!

Диазорегент: смешайте реагент №2 и реагент №3 в соотношении 100:2,5. Диазореагент стабилен не менее 48 часов при комнатной температуре (18·25С) и не менее 10 дней при 4С в плотно закрытой посуде из темного стекла.

Внимание! Тщательно закрывайте флаконы после каждого использования реагентов.

Проведение анализа:

Набор· предназначен для проведения анализа на биохимических полуавтоматических или автоматических анализаторах.

Таблица 19 Общий билирубин

Реагенты

Опытная проба

Контрольная проба

Калибровочная проба

Сыворотка, мкл

200

200

Реагент №1, мкл

1400

1400

1400

Реагент №4, мкл

200

400

200

Калибратор, мкл

200

Диазореагент, мкл

200

200

При определении содержания общего билирубина время инкубации после добавления диазореагента составляет 20 минут при температуре 200С или 15 минут при 37’С. Измерение экстинкции опытной пробы: против соответствующей контрольной пробы произведите при длине волны 535 нм (500 — 560 нм). Экстинкцию калибровочной пробы измерьте тех же условиях против дистиллированной воды.

Таблица 20 Прямой билирубин

Реагенты

Опытная проба

Контрольная проба

Калибровочная проба

Сыворотка, мкл

200

200

Реагент №1, мкл

1400

Реагент №4, мкл

1600

1800

200

Калибратор, мкл

200

Диазореагент, мкл

200

200

При определении содержания прямого (связанного) билирубина время инкубации — 5 минут при 200С или 3 минуты при 37С. Измерение экстинкции опытной пробы против соответствующей контрольной пробы произведите при длине волны 535 нм (500 — 560 нм). Экстинкцию калибровочной пробы измерьте в тех же условиях против дистиллированной воды.

Расчет концентрации (с) общего или прямого билирубина (мкмоль/л) проведите по формуле:

С = (Епробы / Е калибратора) х 85,5 мк/моль/л

Где: Е пробы — экстинкция калибровочной пробы;

85,5 — концентрация билирубина в калибраторе, мкмоль/л;

Нормальные величины:

Общий билирубин — 3,4-17,1 мкмоль/л

Прямой билирубин — 0-4,2 мкмоль/л.

При оценке уровня билирубина в крови есть еще один важный показатель. Количество прямого билирубина должно составлять не более 20-22 % от общего билирубина, а непрямого — 78-80 %.

Клинико-диагностическое значение исследования: Содержание непрямого билирубина в сыворотке крови резко возрастает при гемолитической анемии, пернициозной анемии, гемолитической болезни новорожденных, болезни Жильбера, синдроме Криглера — Найяра, синдроме Ротора.

Содержание прямого билирубина повышено в сыворотке крови больных вирусным гепатитом, циррозом печени, при опухолевых поражениях печени, жировой дистрофии печени, синдроме Дубина — Джонсона.

Требования безопасности;

— При работе с реагентами следует применять индивидуальные средства защиты (резиновые перчатки, спецодежда) ГОСТ 12.4.103, а так же соблюдать общие правила техники безопасности, работы с химическими веществами и биологическим материалом.

Инструменты, оборудование и лабораторную посуду обрабатывать в соответствии с требованием приказа МЗ РБ №165 от 25.11.2002г, СанПиН 22-10 химическими дезинфицирующими средствами, разрешенными к применению МЗ РБ в установленном порядке, согласно инструкции по их применению.

Общие требования к использованию наборов реагентов — медреал:

Не используйте наборы реагентов с истекшим сроком годности.

Не допускайте замораживания реагентов.

Отбирайте из флаконов только необходимое количество реагентов, никогда не сливайте излишки реагентов обратно во флаконы во избежание контаминации. Закрывайте каждый флакон своей крышкой. Перекрестное загрязнение реагентов и/или образцов может привести к получению ложных результатов. Для каждого реагента и исследуемого образца используйте новые сменные наконечники, кюветы, пробирки и др.

Избегайте попадания прямых солнечных лучей во время работы.

При работе с компонентами набора или с образцами всегда надевайте одноразовые перчатки, маски.

Для контроля качества НЕОБХОДИМО использовать контрольные сыворотки Humatrol, $erodos, т.к. совместимость данных сывороток с реагентом-Медреал была подтверждена при проведении клинических испытаний в МЗ РБ. За применение других контрольных сывороток, которые могут привести к недостоверным результатам, производитель ответственности не несет. [10]

Анализатор для клинической химии «Clima МС-15» представляет собой управляемый микропроцессором спектрофотометр, способный выполнять измерение проб и обрабатывать результаты измерения в соответствии с параметрами, заданными пользователем. Прибор оборудован сухим термостатом для инкубации 4 блоков кювет по 15 кювет в каждом, а также мешалкой для гомогенизации проб и реагентов. Конструкция измерительного отделения позволяет выполнить 15 анализов автоматическим образом.

Программирование осуществляется с клавиатуры. Прибор запрашивает требуемые параметры с помощью 160-точечного дисплея, на котором показывается также текущее состояние прибора и флаги. Результаты выводятся непосредственно в единицах измерения, выбранных при программировании, и распечатываются на термобумаге. Этот метод печати позволяет избежать всех проблем технического обслуживания, типичных для принтеров, использующих краситель (ленту, чернила или тонер). Прибор выполняет 15 анализов по конечной точке ориентировочно за 60 секунд. Для кинетических анализов это время составляет 2-4 минуты, в зависимости от используемого метода. Выполнение смешанных измерений по различным методам в одном и том же блоке кювет может занять 5 минут.Прибор снабжён 60 свободными позициями в памяти для хранения методов. Все методы после их запоминания постоянно хранятся в памяти прибора. Возможно выполнение многостандартных тестов по сохранённой в памяти калибровочной кривой

Технические характеристики:

? Моно- и бихроматический режим измерений с высоким разрешением;

? Интерференционные фильтры — 340, 405, 500, 546, 578, 630 и 670 нм;

? Термостат на 4 мультикюветы — (37±0,2)°С;

? Объем реактива на исследование — 500 мкл

? Объем пробы — 5-10 мкл

? Количество программируемых методик в памяти — 60

Преимущества анализаторов BS 200 и BS 200i:

· полностью автоматический, производительность до 200 тестов в час, возможность выполнения срочных проб (Stat)

· автоматический мониторинг остаточного объема реагентов, предварительный подогрев реагентов перед смешиванием

· тщательное перемешивание образцов с минимальными временными затратами и без опасности кросс-контаминации

· автоматическая очистка пробоотборника

· автоматический контроль измерительных кювет

· объем образца на одну пробу от 2 до 45 мкл с шагом в 0,5 мкл

· объем реагента на одну пробу 30 — 450 мкл; конечный объем пробы 180 — 450 мкл

· анализатор произвольного доступа (RandomAccess)

· открытая система

· независимый холодильник на борту

· низкое потребление воды

· многоканальная фотометрирующая система

· Определяемые тесты

Увеличить изображение

Таблица 21 Технические характеристики автоматического биохимического анализатора BS 200

Модель

BS 200/200i

Производительность

без ионселективного блока

200 тестов/час

С ионселективныи блоком

360 тестов/час

Длина волны

340, 405, 450, 510, 546, 578, 630, 670 нм

Объем образца

2 мкл ~ 45 мкл; точность: 0,5 мкл

Количество образцов на борту

40

Объем реагента

30 мкл ~ 450 мкл; точность: 1 мкл

Количество реагентов на борту

40

Наличие охлаждающего блока для реагентов

Есть

Температура охлаждения

4-10 С

Методы измерения

конечная точка, кинетика, двухточечная кинетика, дифференциальный режим, двухволновые методы

Реакционный диск

80 реакционных кювет

Реакционный объем

180 ~ 450 мкл

Количество воды для промывки

3 л/час

Габариты:

Настольный вариант: 780мм x 680мм x 630мм (Ш x Г x В)

Вес:

Настольный вариант: 100кг



Источник: studbooks.net


Добавить комментарий