Пцр анализ качественный или количественный

Пцр анализ качественный или количественный

Переезд склада в Европу.
Реализуем препараты от гепатита С в России по закупочной цене - ликвидация склада
Перейти на сайт

Принцип работы

Молекула дезоксирибонуклеиновой кислоты (собственно ДНК) состоит из двух связанных между собой цепочек из нуклеотидных звеньев.

строение молекулы ДНК

При этом «голова» одной цепочки связана с «хвостом» другой. Водородные связи образуются между строго определенными азотистыми основаниями. В них различные для разных нуклеотидов части. Так, например, гуанин из одной цепочки может связываться только с цитозином другой и т.д. Вот почему, если в наличии имеется одна цепочка ДНК, то следуя правилам взаимодействия можно воспроизвести вторую цепочку. Такая особенность построения ДНК и стала сутью обсуждаемого метода.

Для реализации исследования требуются:

  • анализируемая ДНК или ее кусочек, который станет матрицей для копирования своей части
  • праймеры – созданные синтетически в лаборатории небольшие нуклеотидные последовательности, которые соответствуют по принципу взаимодействия нужным зонам анализируемой ДНК
  • нуклеотиды – «строительный материал»
  • ДНК-полимераза – выделенный из бактерий или архей (своеобразных одноклеточных безъядерных организмов) фермент, который запускает реакцию синтеза от одного конца праймера
  • буфер – раствор, который обеспечивает поддержание необходимой для работы фермента кислотности среды, а также содержит вещества, препятствующие прилипанию реагентов к стенкам реакционного сосуда и предотвращающие нежелательные побочные взаимодействия.

Все смешивают в дистиллированной воде и помещают в амплификатор. Это специальное устройство, в котором реализуется периодические нагрев/охлаждение реакционной смеси с высокой точностью и за считанные секунды.

ПЦР исследование

Обычно требуется синтез кусочков ДНК из 2000-3000 нуклеотидных пар, что достигается за два-три десятка трехэтапных циклов.

Циклы:

  1. Денатурация – разрушение водородных связей путем нагрева и разъединение в результате двух цепочек ДНК.
  2. Отжиг праймеров – присоединение праймеров к освободившимся молекулам ДНК с разных сторон кусочка, который требуется скопировать. Реакция проводится при строго заданной температуре, чтобы данные праймеры взаимодействовали только с нужными зонами. Разработку праймеров проводят с предварительным расчетом с помощью компьютерных программ с учетом всех требований.
  3. Синтез ДНК – собственно построение ДНК-цепи полимеразой из нуклеотидных «кирпичиков». Сначала фермент «крепится» к комплексу матрица-праймер, а затем подбирает необходимый нуклеотид из раствора согласно принципу взаимодействия. Скорость реакции ‑ примерно 3000 нуклеотидов в минуту. Полученная новая молекула служит еще одной матрицей и проходит вместе с «родительской» весь цикл. В результате, количество продукта увеличивается все быстрее и быстрее.

После завершения синтеза на специальном геле с окрашиванием проводят элетрофорез реакционной смеси. Цель – пространственное разделение молекул ДНК, которые становятся заметны визуально (или под УФ-светом). Данный метод позволяет установить, есть ли определенная последовательность нуклеотидных звеньев в исследуемой ДНК. Называется «качественный метод ПЦР».

Другие разновидности ПЦР

Если в роли матрицы исследуемой выступает РНК (например, при изучении РНК вирусов), используется ПЦР с обратной транскрипцией (RT PCR, который важно отличать от такой разновидности, как метод real-time PCR). В данном варианте используется обратная транскриптаза. Это фермент, который по имеющейся РНК выстраивает соответствующую ей ДНК, после чего проводится обычная ПЦР. Для установления в исследуемом материале числа молекул ДНК применяется количественная ПЦР.

диагностика ПЦР количественного типа

Которая и называется real-time PCR, ПЦР «в реальном времени». В этой технике также возможно использование РНК.

В чем заключается главное отличие качественного и количественного методов ПЦР? В последнем случае после каждого цикла проводится замер количества воспроизведенной молекулы флюоресцентными методами. В практической медицине то, какой метод ПЦР качественный или количественный для анализа на инфекции необходим, определяет врач. На основании предполагаемого диагноза и цели исследования (например, для контроля эффективности лечения). В таком режиме часто проводится ПЦР на гепатит С или В. Причем при качественном определении расшифровка результатов не представляет сложности для неспециалиста. Положительный результат — «обнаружено», т.е. выявлен фрагмент ДНК вируса, отрицательный – «не обнаружено». Расшифровать количественный анализ ПЦР на гепатит С можно, воспользовавшись референсными значениями лаборатории, проводившей исследование. Результат «не обнаружено» указывается, если вирусная ДНК вообще не выявлена. Или ее количество меньше предела чувствительности (15-20 МЕ/мл).

  • «Меньше 10 во 2-й степени МЕ/мл» –положительный результат с соответствующим содержанием вируса.
  • «От 10 во 2-й степени до 10 в 8-й степени МЕ/мл» – положительный результат с содержанием вирусных частиц в указанных пределах.
  • «Более 10 в 8-й степени» ‑ концентрация превышает указанное число.

Результат выше верхнего предела измеряемого диапазона, не определяется с достаточной точностью. Различные варианты ПЦР могут использоваться для исследования не ДНК/РНК, а гормонов, токсинов, антител и иных молекул. Принцип такой иммуно-ПЦР ‑ присоединение к выявляемым молекулам (антигенам) ДНК-меченных антител. С последующим копированием ДНК-частей и определением типа и количества анализируемых молекул. Метод позволяет обнаружить инфекционные антигены на самых ранних стадиях болезни.

диагностика инфекций методом ПЦР

Способы осуществления ПЦР

На сегодняшний день существует несколько десятков методик для реализации ПЦР:

  • с горячим стартом – в реакционную среду вносят полимеразу в комплексном соединении с антителами, ингибирующими ее деятельность (поэтому фермент «высвобождается» только в заданный момент реакции);
  • ступенчатая – первые несколько циклов реализуют при более высоких температурах праймерного отжига для увеличения специфичности связывания последних с матричной ДНК, а после накопления некоторого количества новых ДНК-молекул температуру снижают до оптимальной;

суть полимеразной цепной реакции

  • мультиплексная – для выявления сразу нескольких последовательностей используют набор различных праймеров
  • метод RAPD (Random Amplification of Polymorphic DNA – анализ ПЦР случайных полиморфных фрагментов ДНК) – позволяет различить сходные по структуре молекулы, например, дифференцировать виды бактерий, за счет использования очень небольшого праймера (не более 10 нуклеотидов)
  • асимметричная – применяют при необходимости скопировать только одну цепочку анализируемой ДНК, для чего один из праймеров берется в заметном избытке
  • вложенная – используют для снижения количества побочных продуктов за счет добавления двух праймерных наборов и проведения двух реакций последовательно (сначала с праймером для копирования длинного фрагмента, затем – короткого)
  • инвертированная – к методу прибегают, когда последовательность некоторого участка цепи известна, но копирование требуется для другого участка, для чего проводят
    • «разрезание» ДНК рестриктазой
    • «закольцовывание» фрагмента лигазой, так что известные участки оказываются на концах неизвестного
    • проведение стандартной ПЦР
  • цифровая капельная – более точная, чем вариант «в реальном времени», основана на разделении пробы на множество маленьких капель и реализации полимеризации в каждой из них
  • виртуальная – представляет собой аналитический подход для теоретической ПЦР, позволяет оптимизировать подбор праймеров, предсказывать результат копирования и т.д.
  • многое другое.

ПЦР цифрового капельного типа

Таким образом, на сегодняшний день метод является самым мощным вариантом лабораторного исследования.

Его неоспоримые плюсы:

  • высочайшая точность и специфичность
  • совместимость с иными техниками
  • высокая пластичность – возможность решать самые разнообразные задачи
  • постоянное совершенствование, появление новых разновидностей и типов.

Важно понимать, что метод высокочувствителен к минимальным количествам ДНК. Поэтому необходимо очень тщательно соблюдать правила сбора биологического материала. Исключается даже малейшая вероятность загрязнения (со стороны окружающей среды, рук персонала и т.д.).



Источник: prosifilis.ru


Добавить комментарий