Электрофорез белков крови
Основные требования к технологическим системам и процедуре осуществления зонального электрофореза (на хроматографической бумаге, ацетатцеллюлозной пленке, гелях) белков плазмы (сыворотки) крови
Принцип фракционирования (электрофореза) основан на том, что в электростатическом поле белки сыворотки крови движутся по смоченной буферным раствором хроматографической бумаге (ацетатцеллюлозной пленке, крахмаловому, агаровому гелям) со скоростью, зависящей в основном от величины электрического заряда и молекулярной массы частиц. Вследствие этого белки сыворотки крови разделяются обычно на 5 основных фракций: альбумины, α1-глобулины, α2-глобулины, β-глобулины и γ-глобулины, содержание которых определяется с помощью фотометрии или денситометрии. При обработке красителями белки связываются с ними пропорционально своей концентрации. Определив интенсивность окрашивания, можно вычислить концентрацию белковых фракций.
Основные требования к приборам, реагентной базе и процессу осуществления электрофореза
Система для электрофореза. Блок питания должен давать стабилизированный ток силой 50—100 мА при напряжении 180— 600 В.
Электрофоретическая камера. Для предохранения полосы носителя от высыхания в камере должна поддерживаться определенная влажность воздуха. При нагревании бумаги усиленно испаряется буферный раствор в середине полосы и с краев ленты, что обусловливает его движение (реофорез) и вследствие этого изменение формы пятен фракций белков в процессе их электрофоретического разделения; поэтому отдельные конструкции электрофоретических камер располагают системой охлаждения полосок носителя.
В разных отделах камеры буферный раствор должен иметь одинаковый уровень, чтобы избежать его перелива через ленту в результате сифонного действия. Концы полосок носителя не следует погружать в буферный раствор, в котором находятся электроды. Электрическую связь между лентами и электродами устанавливают посредством фитильков из бумажных полосок (ваты, марли), смоченных буферным раствором; этим устраняется передача изменений рН буфера в то пространство, в которое погружены ленты.
Поскольку полоса ацетатцеллюлозной пленки (бумаги) может быть расположена как горизонтально, так и под углом к горизонтали (вертикально), соответственно различают горизонтальный и вертикальный электрофорез. Первый из них позволяет получить более точные результаты. Важно, чтобы полоска носителя (хроматографической бумаги, ацетатцеллюлозной пленки) была хорошо натянута. Желательно, чтобы она располагалась как бы в «подвешенном» состоянии, поддерживаемая вертикально расположенной перегородкой, системой натянутых капроновых нитей, а связывающий обе ванны мостик имел шипы для укладывания на них полосок. Это предотвращает образование тонкого капиллярного слоя буферного раствора между полоской ацетатцеллюлозной пленки, хроматографической бумаги и пластиной; капиллярный слой буферного раствора в значительной мере ухудшает качество электрофоретического разделения.
Большое значение имеют свойства носителя, используемого для электрофореза. Ацетатцеллюлозная пленка, как и хроматографическая бумага, должна быть однородной и плотной. Поскольку в отдельных лабораториях все еще используют хроматографическую бумагу, в отношении ее как носителя необходимо отметить следующее.
Избранный сорт бумаги: «хроматографическая быстрая» или «хроматографическая медленная» — нельзя менять, так как от этого в определенной мере зависят получаемые результаты. Если хроматографическая бумага подлежит денситометрии, то рекомендуется быстро впитывающий сорт, в остальных случаях предпочтительнее пользоваться бумагой для медленного впитывания (марки «М»). Бумага марки «М» имеет гладкую лицевую и рубчатую обратную стороны. При внимательном рассмотрении обратной стороны можно заметить грубые и крупные штрихи, идущие параллельно более длинной стороне листа. Эти штрихи отражают ход волокон целлюлозы. Применяемые для электрофореза бумажные полоски, размером 3,5 х 40 см (или другого формата, соответствующего габаритам электрофоретической камеры), нарезают таким образом, чтобы волокна целлюлозы шли вдоль полосок. Благодаря этому каждая полоска бумаги представляет собой систему продольно идущих капилляров, что способствует продвижению белков (и других веществ) и препятствует их растеканию к краям полоски. Кроме того, полученная лента, в отличие от аналогичной с поперечным ходом волокон целлюлозы, меньше деформируется при увлажнении и высыхании. На одном из концов каждой полоски простым карандашом отмечают номер анализа и дату взятия крови для исследования.
Направление хода волокон целлюлозы в бумаге можно определить и по растеканию на ней капли воды, принимающей форму эллипса, длинник которого и соответствует распространению волокон целлюлозы.
Подготовка к электрофорезу и процедура его проведения. Перед электрофорезом камеру устанавливают строго горизонтально. Кюветы заполняют буферным раствором таким образом, чтобы уровень жидкости в них был одинаков. Оба отделения каждой кюветы соединяют друг с другом полоской фильтровальной бумаги. Полоски ацетатцеллюлозной пленки (хроматографической бумаги) равномерно натягивают между кюветными отделениями. Необходимо, чтобы концы увлажненных буфером полос (мембран) были погружены в буферный раствор внутренних отделений (если таковые имеются) электродных кювет. Затем на заранее отмеченные у катода участки полосы носителя наносят сыворотку (иногда на расстоянии 2 см от середины полоски в сторону катода).
Наилучшие результаты дает метод пропитывания хроматографической бумаги буферным раствором. Однако на практике в целях экономии времени ленты обычно смачивают в буфере и слегка высушивают, отжимая между листами фильтровальной бумаги.
Нанесение на полоску носителя биологического материала осуществляется с помощью аппликатора (специального или импровизированного) либо микропипетки (автоматической, обычной). При первом способе на узкий край шлифованного стекла (покровного, предметного) или полоски отмытой рентгеновской пленки наносят 0,1-миллилитровой микропипеткой 10 мкл (0,01 мл) свежеполученной (негемолизированной) сыворотки.
Этот импровизированный аппликатор приставляют нижним ребром к увлажненной бумаге и после впитывания сыворотки сразу же отнимают (нужно следить за тем, чтобы между боковыми гранями аппликатора и краями полос оставался промежуток шириной 5—6 мм). Наносить сыворотку на бумагу можно и непосредственно из пипетки — таким образом, чтобы след сыворотки составил поперечную (по отношению к длиннику бумаги) полоску.
В том и другом случаях нужно соблюдать следующие правила: если используют микропипетку на 0,1 мл, в нее насасывают сыворотку до метки 0,085. Пипетку зажимают между пальцами в вертикальном положении, причем верхнее ее отверстие не следует закрывать пальцем. Небольшое количество сыворотки, находящееся в пипетке, не вытекает из нее, так как жидкость удерживается капиллярными силами. Слегка касаясь бумаги (материала ацетатцеллюлозной пленки) нижним краем пипетки, ее перемещают по полосе в поперечном направлении (не доводя пипетку на 2 мм до каждого края), пока мениск сыворотки не опустится до метки 0,095. Удобно пользоваться и автоматической микропипеткой.
Допустимо окрашивание сыворотки перед ее нанесением на полосу хроматографической бумаги. Для этого к 0,5 мл сыворотки добавляют несколько крупинок (проще всего на кончике стеклянной иглы) порошка бромфенолового синего. По перемещению пятна красителя, связывающегося, прежде всего с альбумином, можно визуально следить за миграцией пятен.
Затем крышку камеры плотно закрывают и включают прибор.
Электрофоретическое разделение белков сыворотки крови осуществляют при комнатной температуре и градиенте потенциала от 3 до 8 В на 1 см длины полоски носителя. Сила тока, зависящая от величины подаваемого напряжения, разновидности, особенностей состава и рН буферного раствора, толщины полоски носителя (хроматографической бумаги или ацетатцеллюлозной пленки), температуры, при которой происходит разделение, не должна превышать 0,1—0,3 мА на 1 см поперечного сечения хроматографической бумаги или ацетатцеллюлозной пленки. Оптимальное время электрофореза подбирают опытным путем. Обычно оно составляет 20—40 мин при электрофорезе на ацетатцеллюлозной пленке и 7—12 ч при электрофорезе на хроматографической бумаге. По окончании электрофореза отключают источник постоянного тока, из камеры извлекают бумажные полоски и прикрепляют их на деревянные рамки или развешивают на стеклянных палочках, затем бумажные полоски помещают в горячий сушильный шкаф так, чтобы они не касались ни друг друга, ни металлических стенок и деталей шкафа (это предохраняет электрофореграммы от смазывания фракций).
Бумажные ленты высушивают в шкафу при 95—1050С в течение 10—15 мин, но не более 20—30 мин. Поскольку связывание индикатора (красителя) белками при последующей обработке зависит от условий фиксации (температуры, времени прогревания), необходимо строго соблюдать их постоянство.
Полоски ацетатцеллюлозной пленки (мембраны) не высушивают и далее обрабатывают влажными.
Для окраски электрофореграмм сухие бумажные ленты или увлажненные буферным раствором ацетатцеллюлозные пленки кладут в развернутом виде на дно плоских эмалированных кювет и осторожно, медленно приливают красящий раствор. В процессе обработки реагентами электрофореграммы нельзя накладывать друг на друга и сворачивать.
Реактивы.
1. Буферные растворы. На электрофоретическое фракционирование белков большое влияние оказывает рН буферных растворов, состав и концентрация составляющих их реагентов, так как от кислотности (щелочности) среды, ионной силы буферной смеси и некоторых других факторов во многом зависят знак и величина электрического заряда молекул белков.
В качестве электролита чаще всего применяют веронал-мединаловый, веронал-ацетатный, мединаловый, трис-буфер. Реже используют боратный и фосфатный буфер.
Наиболее хорошо зарекомендовали себя следующие буферные растворы:
ü Вероналовый (веронал-мединаловый) буфер с рН 8,6.
ü Веронал-ацетатный буфер с рН 8,6.
ü Мединаловый буфер с рН 7,6.
ü Трис-буфер с рН 8,9 (очень хорошо разделяются белки сыворотки крови (с выделением до 9 фракций) при использовании трис-буфера с рН 8,9).
2. Окрашивающие реагенты. Основным их компонентом являются индикаторы (бромфеноловый синий, кислотный сине-черный, амидо черный 10 В и некоторые другие), представляющие собой красители, характерно связывающиеся с белком.
Сухие бумажные ленты выдерживают в этих красителях в течение 30 мин. Входящие в состав красящих растворов сулема, сульфат цинка и уксусная кислота выступают в роли фиксаторов, способствующих улучшению связывания красителя с белком.
3. Отмывающие растворы. Для удаления не связавшегося с белком красителя электрофореграммы обрабатывают в нескольких (обычно 3—5) сменах отмывающего раствора — до тех пор, пока фон лент не сделается светлым (белым), а промывная жидкость не перестанет окрашиваться в желтый цвет. Состав отмывающего раствора во многом зависит от природы применявшегося для окрашивания белков индикатора. Так, при окраске бромфеноловым синим используют раствор уксусной кислоты, получаемый добавлением к 20 мл ледяной уксусной кислоты 980 мл дистиллированной (или водопроводной) воды; в случае применения амидо черного 10 В или кислотного сине-черного не связавшиеся с белком красители отмывают смесью следующего состава: уксусной кислоты (ледяной) — 100 мл, фенола (расплавленного) — 40 мл, воды водопроводной — 860 мл.
Подготовка электрофореграмм к учету результатов способами денситометрии и фотометрии. Бумажные ленты, отмытые от избытка красителя, высушивают на воздухе при комнатной температуре, притом в затемненном месте, если в качестве красителя использовался бромфеноловый синий. Сухие и окрашенные электрофореграммы хранятся в темноте.
Дальнейшая количественная обработка электрофореграмм состоит либо в элюции (извлечении) красителя из участков бумаги с располагающимися на них окрашенными белковыми фракциями с последующим фотометрическим измерением оптической плотности растворов, либо непосредственной записи электрофореграмм с помощью денситометра – прибора, позволяющего регистрировать (сканировать) картину разделения фракций анализируемых веществ в отраженном или проходящем монохроматическом световом потоке.
При денситометрии в проходящем свете предварительно обесцвечивают фон ацетатцеллюлозных пленок и бумажных лент (последние для этого пропитывают просветляющей жидкостью либо обесцвечивают материал носителя другим способом). Полосу располагают в перемещающем ее устройстве таким образом, чтобы против щели освещения находился неокрашенный участок. Записанная прибором кривая позволяют судить о числе фракций и о содержании в них белка. С помощью интегрального устройства осуществляется количественная обработка картины разделения фракций белков, осуществляемая в автоматическом режиме.
Количественную обработку денситограмм можно выполнить и ручным способом. Для этого кривую делят на ряд участков, соответствующих отдельным фракциям. Величина площади каждого участка пропорциональна количеству красителя, соединившегося с белком данной фракции. Соотношение между этими площадями вычисляют, например, по массе вырезанных участков бумаги, определенной на торсионных весах. Общую массу всех участков принимают за 100% (1,0) или же за содержание общего белка в плазме (в г/л) и вычисляют, какой процент по отношению к нему составляет масса каждого участка (фракции).
Для просветления электрофореграмм (перед «сканированием» в проходящем свете на денситометре) применяют: вазелиновое масло и раствор альфа-бромнафталина в вазелиновом масле – для обесцвечивания фона бумажных лент, а также смеси: ледяная уксусная кислота – ацетон (1:1); пропиловый (изопропиловый) спирт – ледяная кислота – глицерин (85:12:3) – используют для просветления материала ацетатных полос.
Метод элюирования состоит в том, что сначала электрофореграммы разрезают по числу фракций, ориентируясь на самый светлый участок между ними. Каждую фракцию помещают в отдельную пробирку и заливают, например, 3 мл элюирующего раствора. К альбуминовой фракции добавляют двойной (или тройной) его объем, на основании чего величину оптической плотности для альбуминовой фракции умножают на 2 (или на 3). Контролем служит участок фореграмм, не содержащий белка. Пробирки осторожно встряхивают и оставляют в затемненном месте на 30 минут (лучше на 40 минут – 1 час). Плотность испытываемых растворов определяют на фотоэлектроколориметре любого типа с зеленым (красным) светофильтром. В качестве контрольного используют элюирующий раствор, по которому устанавливают «электрический нуль» прибора.
При использовании способа элюирования находят величину абсорбции каждой фракции и общую сумму значений оптической плотности, которую принимают за 100% (либо 1,0) или величину содержания общего белка в плазме (сыворотке) крови, представленную в размерности г/л. В первом случае результаты выражают в относительных, во втором – в абсолютных единицах.
Состав элюирующих растворов, применяемых для извлечения красителя из окрашенных фракций электрофореграмм (эстрагирующие реагенты), во многом зависит от природы используемого индикатора. Так, для извлечения бромфенолового синего применяют 0,01Н раствор едкого натра. Для извлечения кислотного сине-черного красителя используют 0,1Н раствор едкого натра.
Приняв сумму показателей оптической плотности отдельных элюатов за 100% (1,0), по простому тройному правилу рассчитывают относительное содержание альбумина и фракций глобулинов.
Пример. Абсорбция фракции альбумина – 0,52, α1-глобулины – 0,02, α2-глобулины -0,05, β-глобулины-0,10, γ-глобулины-0,15. В сумме оптическая плотность отдельных растворов равна 0,84; это значение принимается за 100% (или 1,0).
Тогда содержание альбумина, выраженное в относительных единицах, составит: (0,52 • 1,0)/0,84 = 0,62. Подобным же образом рассчитывают относительное содержание всех остальных белковых фракций, выражая его в долях от единицы или процентах. Следует стремиться к представлению результатов не в относительных, а в абсолютных единицах. Для этого сумму показателей абсорбции всех фракций достаточно отнести к концентрации общего белка сыворотки крови. Тогда, пользуясь аналогичным расчетом, легко найти действительную концентрацию альбумина и всех глобулинов.
Пример. Общее количество белка в сыворотке крови — 82 г/л. Сумма абсорбции всех фракций — 0,84. На долю абсорбции фракции альбумина приходится 0,52 ед. Если показатель А, равный 0,84 ед, соответствует 82 г/л, то 0,52 (А) — х. Отсюда: концентрация альбумина в сыворотке крови равна (82 • 0,52)/0,84 = 50,7 (г/л).
Зная содержание общего белка сыворотки (плазмы) крови, легко перевести относительные единицы в абсолютные: 100% соответствует 82 г/л, 62,0% — х. Тогда х = (62,0 • 82)/100 = 50,8 (г/л).
Для лучшего запоминания отмечаемых в норме показателей процентного (долевого от единицы) содержания альфа-1 -, альфа-2-, бета- и гамма-глобулинов сыворотки крови можно ориентироваться на следующие средние величины и варианты отклонений: 1 (0,04 + 0,01), 8± 1 (0,08 ±0,01), 10 ± 2 (0,10 ± 0,02), 16 + 4 (0,16 + 0,04) — соответственно. Относительное содержание альбумина составляет, по данным А.А.Покровского (1969), 56—66% (0,56—0,66), многих других авторов: 50—61% (0,50—0,61). У практически здоровых взрослых людей концентрация альбумина, альфа-1-, альфа-2-, бета- и гамма-глобулинов, выраженная в абсолютных единицах, составляет соответственно: 42,0—51,0, 2,0— 5,0, 4,0-7,0, 5,0-9,0, 8,0-17,0 г/л.
Краткая характеристика других носителей.
В последние годы электрофорез на бумаге практически полностью вытеснен предложенным Коном (1958) электрофорезом на ацетатцеллюлозе. Ацетатцеллюлозная пленка в отличие от бумаги лишена эндоосмоса, способности к поглощению отдельных белковых фракций поверхностью волоконец. В результате получается четкое фракционирование со светлыми промежутками между «пятнами» белков, а время электрофореза сокращается обычно до 30 мин.
Для разделения фракций белков и липопротеинов широко используется метод электрофореза на агаре (агарозе), предложенный Гордоном и др. в 1949 г.
Способ электрофореза в крахмальном геле (Смитис, 1955) позволяет получить до 20 фракций вместо пяти, обычно выделяемых методом электрофоретического фракционирования на бумаге.
Введенный Грабаром и Вильямсом в 1953 г. иммуноэлектрофорез представляет собой комбинацию электрофоретического и иммунологического фракционирования белков. После передвижения белковых фракций в геле агара в узкий желобок помешают перпендикулярно к фракционным линиям сыворотку лошади, иммунизированной белковыми компонентами сыворотки человека (антисыворотка). Антисыворотке дают возможность диффундировать в геле агара. В месте контакта содержащихся в них антител с электрофоретически разделенными белковыми фракциями образуются преципитационные дуги, характерные для соответствующих фракций. При помощи этого метода обнаруживается не менее 25 различных белков.
Структура агарового и крахмального геля такова, что размеры пор в этих носителях, как и в материале бумаги, ацетатцеллюлозной пленки, значительно превосходят размеры макромолекул: белков, липопротеинов и др. Лишь в полиакриламидном геле, формируемом из золя с концентрацией около 7,5%, размеры пор примерно соответствуют размерам молекул белков. Благодаря этому создается молекулярно-фильтрующий эффект, в значительной мере улучшающий качество электрофоретического разделения, с помощью которого выделяется обычно около 30 фракций белков. К тому же перед началом электрофоретического Фракционирования белков все они стартуют с весьма узкой линии, будучи как бы сконцентрированы на ней. Формирование многослойного полиакриламидного геля, отдельные зоны в котором отличаются размерами пор, дает возможность эффективно разделять липопротеины разных классов (по Е.Я. Маграчевой, 1979). К тому же полиакриламидный гель отличается большой прозрачностью, термостабильностью. Широкое применение в клинической практике метода электрофореза в полиакриламидном геле сдерживается трудностью идентификации и количественного учета отдельных выявляемых фракций.
Определение белковых фракций сыворотки крови методом электрофореза на пленках из ацетата целлюлозы.
Принцип метода: белки сыворотки крови разделяют методом электрофореза с использованием в качестве носителя пленки из ацетата целлюлозы.
Реактивы: 1) барбитал-натриевый буферный раствор (рН 8,6) (иногда применяются другие буферные смеси); 2) бромфеноловый синий (при приготовлении раствора добавляют сульфат цинка и уксусную кислоту для фиксации белков); 3) отмывающий раствор – уксусная кислота, 50 г/л; 4) просветляющий раствор: вазелиновое масло, смесь ледяной уксусной кислоты с ацетоном (1:1).
Ход определения: смачивают пленки буферным раствором (помещают в буферный раствор на 5 минут). Удаляют избыток влаги фильтровальной бумагой. Закрепляют пленку в камере матовой стороной кверху (пленки должны располагаться параллельно друг к другу и строго параллельно стенкам прибора, не должны свисать). Закрывают камеру крышкой и пропускают ток напряжением 150В в течение 5 минут, после чего выключают ток.
Продолжение »
Источник: bioximia.narod.ru