Гепатит ингибиторы протеазы

Гепатит ингибиторы протеазы

The Molecular Basis of Drug Resistance against Hepatitis C Virus NS3/4A Protease Inhibitors
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3406087/

Задуманные и разработанные эксперименты: CAS KPR AA. Выполнены эксперименты: KPR AA CA DS AO LMD CS HC AN WH. Проанализированы данные: KPR AA CAS. Используемые реагенты / материалы / инструменты анализа: KPR AA CA DS AO LMD CS HC AN CJP WH. Написал документ: KPR AA CAS.

Вирус гепатита С (HCV) заражает более 170 миллионов человек во всем мире и является основной причиной хронических заболеваний печени, включая цирроз, печеночную недостаточность и рак печени. Доступные противовирусные терапии вызывают серьезные побочные эффекты и эффективны только для подмножества пациентов, хотя недавно были улучшены результаты лечения комбинированной терапией, включая боцепревир и telaprevir, которые ингибируют вирусную NS3 / 4A-протеазу. Однако, несмотря на обширные усилия по разработке более мощных ингибиторов протеазы следующего поколения, долгосрочная эффективность этого класса лекарств вызвана быстрым появлением резистентности. Однородные мутации у протеазных остатков R155, A156 и D168 оказывают устойчивость почти ко всем ингибиторам в клиническом развитии. Таким образом, разработка препаратов следующего поколения, которые сохраняют активность против более широкого спектра резистентных вирусных вариантов, требует всестороннего понимания молекулярной основы резистентности к лекарственным средствам. В этом исследовании 16 кристаллических структур с высоким разрешением четырех типичных ингибиторов протеазы — telaprevir, данопревир, ванипревир и МК-5172 — в комплексе с протеазой дикого типа и тремя основными лекарственно-устойчивыми вариантами R155K, A156T и D168A выявили уникальные молекулярные основы устойчивости к каждому препарату. Препараты проявляют дифференциальную восприимчивость к этим вариантам протеазы как в ферментативном, так и в противовирусном анализе. Телапревир, данопревир и ванипревир взаимодействуют непосредственно с сайтами, которые придают мутации устойчивость, а МК-5172 взаимодействует в уникальной конформации с каталитической триадой. Этот новый способ связывания MK-5172 объясняет его сохраненную способность к двум вариантам, устойчивым к нескольким лекарственным средствам, R155K и D168A. Эти результаты определяют молекулярную основу резистентности ингибиторов протеазы HCV N3 / 4A и дают потенциальные стратегии для разработки надежных методов лечения против этого быстро развивающегося вируса.

Вирус гепатита С (HCV) заражает более 170 миллионов человек во всем мире и является основной причиной хронических заболеваний печени, включая цирроз, печеночную недостаточность и рак печени. Разрабатываются новые классы противовирусных агентов прямого действия, которые нацелены на различные ферменты HCV. Два таких препарата, которые нацелены на существенную протеазу NS3 / 4A HCV, одобрены FDA, а некоторые другие находятся на разных стадиях клинического развития. Эти препараты при использовании в сочетании с пегилированным интерфероном и рибавирином значительно улучшают результаты лечения. Однако HCV развивается очень быстро, и лекарственная устойчивость развивается против антивирусных агентов прямого действия. Таким образом, несмотря на терапевтический успех ингибиторов протеазы NS3 / 4A, их долгосрочная эффективность оспаривается лекарственной устойчивостью. В нашем исследовании подробно объясняется, как и почему лекарственная устойчивость возникает у четырех химически репрезентативных ингибиторов протеазы -телепревира, данопревира, ванипревира и МК-5172. Потенциально благодаря этим знаниям могут быть разработаны новые препараты, которые менее восприимчивы к лекарственной устойчивости. В более общем плане, понимание основных механизмов, с помощью которых возникает лекарственная устойчивость, может быть включено в развитие лекарственного средства для многих быстро развивающихся болезней.

Вирус гепатита С (HCV) представляет собой генетически разветвленный вирусный РНК-вирус семейства Flaviviridae, заражающий примерно 170 миллионов человек во всем мире [1], [2]. Основываясь на генетическом разнообразии, ВГС делится на шесть основных генотипов (генотипы 1-6) и многочисленные подтипы с различными географическими распределениями; генотипы 1 и 3 являются наиболее распространенными во всем мире [3]. Инфекция HCV является основной причиной хронического заболевания печени, которое сохраняется на протяжении десятилетий и в конечном итоге переходит к циррозу, печеночной недостаточности или раку печени [4]. Нынешний стандарт ухода против HCV представляет собой комбинацию пэгилированного интерферона (Peg-IFN), рибавирина (RBV) и боцепревира или telaprevir, двух недавно одобренных противовирусных агентов, нацеленных на вирусную NS3 / 4A-протеазу [5]. Устойчивый вирусологический ответ (SVR), который равнозначен вылечению, достигается только у поднабора обработанных пациентов в зависимости от комбинации вирусных и хозяин-клеточных генетических факторов [6] — [10]. Например, полиморфизм человека на гене IL28B связан с плохим ответом интерферона [11]. Большинство пациентов, проходящих терапию на основе интерферона, также испытывают значительные побочные эффекты, включая симптомы гриппа, анемию и депрессию [12]. Таким образом, современные анти-HCV-терапии часто не переносятся и неэффективны для многих пациентов, и для более безопасного и более эффективного лечения требуются новые противовирусные препараты прямого действия.

Противовирусные агенты прямого действия могут улучшить показатели УВО и минимизировать продолжительность лечения. Протеаза HC3 NS3 / 4A — химотрипсиноподобная сериновая протеаза — является основной терапевтической мишенью, которая расщепляет четыре известных участка вдоль кодируемого вирусом полипротеина [13]. Протеаза NS3 / 4A также гидролизует два человеческих белка, TRIF и MAVS, которые являются частью врожденной иммунной системы, тем самым смешивая врожденный иммунный ответ на вирусную инфекцию [14], [15]. Фармацевтические компании вложили значительные усилия в разработку NS3 / 4A ингибиторов протеазы. Доказательство концепции антивирусной эффективности было впервые продемонстрировано в 2002 году с помощью макроциклического ингибитора BILN-2061 (ciluprevir) [16], [17], который был позже прекращен из-за опасений относительно его кардиотоксичности [18]. Как отмечено выше, boceprevir [19] и telaprevir [20], [21] являются двумя ингибиторами протеазы NS3 / 4A, недавно одобренными Управлением по контролю за продуктами и лекарствами, что является важной вехой в исследованиях против HCV и развитии лекарств в течение последних двух десятилетий , Оба боцепревира и telaprevir представляют собой линейные кетоамидные соединения, которые образуют обратимую ковалентную связь с каталитическим серином NS3 / 4A-протеазы. Несколько нековалентных ингибиторов xprotease также продвинулись в клинические испытания человека; эти ингибиторы включают как линейные (BMS-650032 [22], BI 201335 [23]), так и макроциклические соединения, содержащие либо P1-P3 (данопревир [24], TMC435 [25]), либо P2-P4 (ванипревир [26] , MK-5172 [27]) макроцикл (рис. 1).

Каноническая номенклатура позиционирования лекарственного вещества указана с использованием telaprevir. Телапревир (черный), данопревир (красный), ванипревир и МК-5172 (синий) являются представителями многих других ингибиторов протеазы в развитии. Телапревир, недавно одобренный для клинического применения, представляет собой ациклический ингибитор кетоамида, который образует обратимую ковалентную связь с протеазой. Данопревир, в настоящее время находящийся в фазе II клинических испытаний, является нековалентным ингибитором ацилсульфонамида с макроциклом P1-P3. Ванипревир и МК-5172 также являются нековалентными ингибиторами ацилсульфонамидов, но содержат макроциклы P2-P4. Ванипревир и МК-5172 отличаются конструкцией их Р2-фрагментов: ванипревир содержит карбаматную связь между пролином Р2 и изоиндолиновым фрагментом, тогда как МК-5172 содержит более короткое эфирное соединение между его пролином Р2 и хиноксалиновой частью.

Ингибиторы NS3 / 4A-протеазы быстро снижают титры РНК HCV при введении в виде монотерапии [17], [28] — [31] и существенно улучшают скорости УВО при назначении в комбинации с Peg-IFN и RBV [6] — [10], [ 32] — [34]. Однако высокая скорость репликации HCV и слабая верность РНК-зависимой РНК-полимеразы HCV приводят к гетерогенным популяциям вируса у инфицированных пациентов [35], [36]. Эти вирусные quasispecies существуют на низких уровнях у пациентов, не получавших лечение, и устойчивые популяции возникают под действием селективного давления противовирусных агентов прямого действия [36] — [38]. У большинства пациентов, подвергающихся терапии ингибиторами протеазы, резистентность развивается быстро из-за перекрывающихся, но различных наборов мутаций NS3 / 4A [37]. У пациентов с генотипом 1a мутация R155K вызывает устойчивость против почти всех ингибиторов, но редко встречается у пациентов с генотипом 1b [29], [30], [32], [37] — [42]. Вместо этого у пациентов с генотипом 1b возникают различные мутации устойчивости, в зависимости от используемого класса ингибитора протеазы; A156 мутирует в ответ на лечение линейными ингибиторами кетоамидной протеазы [39] — [41], тогда как макроциклические ингибиторы чаще всего выбирают варианты D168A и R155K [29], [30], [32], [42]. Мутации в V36, T54 и V36 + A155 также связаны с резистентностью к ингибиторам кетоамида [39] — [41]. Вариации в моделях устойчивых мутаций возникают из-за сложного взаимодействия генотипа, скорости репликации, скоростей мутаций и результирующего эффекта мутаций на вирусную пригодность и эффективность лекарственного средства. Очевидно, что, несмотря на преимущества комбинированной терапии при повышении частоты УВО, возникновение резистентности вызывает долгосрочную эффективность ингибиторов протеазы NS3 / 4A.

Большинство первичных лекарственно-устойчивых мутаций в протеазе NS3 / 4A встречаются вокруг активного сайта в областях, где лекарственные средства выступают из области связывания субстрата, определяемой как оболочка субстрата, поскольку эти изменения могут предпочтительно нарушать связывание лекарственного средства с минимальным воздействием на связывание субстрата и вирусную пригодность [43]. Ингибиторы протеазы данопревир, TMC435 и боцепревир выступают из оболочки субстрата в областях, которые коррелируют с известными сайтами резистентных мутаций. Примечательно, что большие P2-фрагменты данопревира и TMC435 связываются на субсайте S2 и широко взаимодействуют с остатками R155, D168 и A156 [43], которые мутируют для обеспечения устойчивости к нескольким лекарственным средствам [37], [38], [44]. Эти и другие ингибиторы с большими фрагментами Р2 получают большую часть своей активности от связывания в субстрате S2 [45], но то, как молекулярные изменения у этих остатков выборочно ослабляют связывание ингибитора без ущерба для связывания вирусных субстратов, неясны. Поэтому выяснение основных молекулярных механизмов устойчивости ингибитора протеазы NS3 / 4A является необходимым условием для разработки новых лекарств, которые менее восприимчивы к резистентности.

Как одностадийные мутации у остатков R155, A156 и D168 придают устойчивость к большинству ингибиторов протеазы, не были выяснены в атомных деталях. В этом исследовании сообщается, что четыре химически репрезентативных ингибитора протеазы — telaprevir, danoprevir, vaniprevir и MK-5172 — проявляют отчетливую восприимчивость к вариантам протеазы R155K, A156T и D168A (таблица 1). Шестнадцать кристаллических структур с высоким разрешением ингибиторов в комплексе с протеазой дикого типа и тремя вариантами, устойчивыми к лекарственным средствам, показывают молекулярную основу, лежащую в основе уникальных профилей резистентности этих ингибиторов (таблица 2). Хиноксалинная часть P2 MK-5172 стекает против каталитической триады протеазы в новой конформации, объясняя ее сохраненную активность против R155K и D168A. Гибкий фрагмент изоиндолина P2 данопревира, содержащий макроциклические пакеты P1-P3 против мутированных поверхностей вариантов A156T и D168A, объясняя его относительно более высокую активность против обоих вариантов протеазы. Однако изоиндолиновый фрагмент в ванипревире ограничен из-за макроцикла P2-P4, что приводит к значительно меньшей активности по отношению ко всем трем вариантам. Таким образом, включение либо хиноксалиновых, либо гибких заместителей в пролин Р2 дает очевидные преимущества. В совокупности эти данные показывают потенциальные стратегии для разработки новых лекарств, которые сохраняют потенцию против более широкого спектра устойчивых вирусных вариантов.

Числа в круглых скобках отражают изменение смены по сравнению с диким типом; > указывает значения IC50 и Ki выше, чем максимальная концентрация лекарственного средства, проверенная в анализе.

Мутант S139A протеазы, используемый для кристаллизации.

псевдомероэдральный близнец.

значения в скобках для оболочки с высоким разрешением.

AU, асимметричная единица.

Rsym = Σ | I- | / ΣI, где I = наблюдаемая интенсивность, = средняя интенсивность по сравнению с эквивалентом симметрии.

RMSD, среднеквадратичное отклонение.

р
работа = Σ∥Fo | — | Fc∥ / Σ | Fo |. р
свободный был рассчитан из 5% отражений, выбранных случайным образом, которые были исключены из процесса уточнения.

*: γ = 120,0.

Наркотиковую активность определяли для telaprevir, danoprevir, vaniprevir и MK-5172 против генотипа 1a HCV дикого типа и резистентных вариантов R155K, D168A и A156T с использованием анализов на ингибирование на основе репликона. Противовирусные активности против резистентных вариантов были связаны с изменениями аффинности связывания, измеренными в анализах ингибирования фермента (таблица 1). Против протеазы дикого типа, макроциклические ингибиторы данопревир, ванипревир и МК-5172 проявляли противовирусные потенции в субмикробном диапазоне (IC50 = 0,24, 0,34 и 0,11 нМ соответственно), тогда как активность telaprevir была значительно ниже (IC50 = 1030 нМ), последовательная с предыдущими докладами [46], [47]. По сравнению с диким типом R155K вызывал значительное снижение активности у данопревира и ванипревира, но MK-5172 оставался очень активным (R155K IC50 = 0,55 нМ). Эффективность Telaprevir была немного лучше против D168A по сравнению с диким типом, тогда как данопревир, ванипревир и МК-5172 теряли потенцию от 100 до 1000 раз против D168A. Однако как данопревир, так и МК-5172 все еще были значительно более сильными, чем телапревир против D168A. Среди макроциклических препаратов данопревир и МК-5172 сохраняли более высокую активность против D168A (D168A IC50 = 48 нМ и 13 нМ соответственно) относительно ванипревира (D168A IC50> 400 нМ). Данопревир также сохранил значительно более высокую активность против A156T (A156T IC50 = 5,7 нМ), в то время как другие три препарата понесли большие потери в потенции. Примечательно, что MK-5172, хотя и активен в отношении двух других вариантов, потерял значительную эффективность против A156T (A156T IC50 = 108 нМ). Таким образом, четыре препарата проявляли различную восприимчивость к резистентным к ингибиторам протеазам вирусным вариантам R155K, D168A и A156T.

Для выяснения основополагающего механизма, с помощью которого химически разнообразные ингибиторы связываются с протеазой дикого типа и резистентными к лекарственным средствам вариантами, кристаллические структуры были определены для 16 ингибиторно-протеазных комплексов. Эти комплексы включают протеазу дикого типа и резистентные варианты R155K, D168A и A156T, каждый из которых связан с telaprevir, данопревиром, ванипревиром и МК-5172, с разрешением в диапазоне от 1,10-2,50 Å (таблица 2); Использовались варианты протеазы S139A, за исключением telaprevir, который требует образования ковалентной связи с серином 139 для эффективного связывания. Эти наборы данных с высоким разрешением позволили получить очень подробные структурные интерпретации связывания лекарственно-протеазы.

Связывание конформаций telaprevir, данопревира, ванипревира и МК-5172 с протеазой дикого типа показано на фиг. 2 и фиг. S1. Во всех комплексах ингибиторы образовывали три общие водородные связи с основной цепью протеазы (таблица S1): (1) азот P1 амида с карбонильным кислородом R155, (2) карбонильный кислород P3 с амидным азотом A157 и (3 ) азот P3 амида с карбонильным кислородом A157 (фиг. 3A-

6A). Амидный азот P5 telaprevir образовывал дополнительную водородную связь с карбонильным кислородом S159. В комплексе telaprevir каталитический серин (S139) ковалентно связывался с C-α -углеем кетоамидной боеголовки. Кетоамидный кислород сидел в оксианионной дыре и взаимодействовал с магистральными амидными нитрогенами протеазных остатков 137-139, в то время как азот Nε водорода H57, связанный с кетокислотой. Ацилсульфонамидные группы данопревира, ванипревира и МК-5172 также были помещены в оксианионную дыру, водородную связь с тем же набором азотных аминов основной цепи, как это наблюдалось ранее для структур TMC435 и данопревира [43], [45]. Между тем азот Nε H57 взаимодействовал с сульфонамидным азотом в этих комплексах, предполагая, что атомы Nε депротонированы. Таким образом, многие из этих классов ингибиторов перекрываются в нескольких ключевых взаимодействиях с протеазой.

Поверхностные представления протеазы дикого типа в комплексе с (A) telaprevir, (B) данопревиром, (C) ванипревиром и (D) MK-5172. Каталитическая триада показана желтым цветом, а боковые цепи R155, A156 и D168 подсвечиваются светло-синим, бледно-зеленым и красным соответственно.

(А) Телапревир связан с протеазой дикого типа с огибающей подложки в синем. Внутри- и межмолекулярные связи водородной связи отмечены красными и серыми пунктирными линиями. Телапревир также показан связанным с лекарственно-устойчивыми вариантами (B) R155K, (C) D168A и (D) A156T с прозрачными координатами, представляющими структуру дикого типа, чтобы лучше выделить молекулярные изменения каждой мутации. Во всех случаях каталитические остатки изображены желтым цветом, субстрат Р2 розовым и молекулы лекарственного средства в оранжевом.

(A) Данопревир связан с протеазой дикого типа с оболочкой подложки в синем. Внутри- и межмолекулярные связи водородной связи отмечены красными и серыми пунктирными линиями. Данопревир также показан связанным с лекарственно-устойчивыми вариантами (B) R155K, (C) D168A и (D) A156T с прозрачными координатами, представляющими структуру дикого типа, чтобы лучше выделять молекулярные изменения каждой мутации. Во всех случаях каталитические остатки изображены желтым цветом, субстрат Р2 розовым и молекулы лекарственного средства в оранжевом.

(A) Ванипревир связан с протеазой дикого типа с огибающей подложки в синем. Внутри- и межмолекулярные связи водородной связи отмечены красными и серыми пунктирными линиями. Ванипревир показан связанным с лекарственно-устойчивыми вариантами (B) R155K, (C) D168A и (D) A156T с прозрачными координатами, представляющими структуру дикого типа, чтобы лучше выделить молекулярные изменения каждой мутации. Во всех случаях каталитические остатки изображены желтым цветом, субстрат Р2 розовым и молекулы лекарственного средства в оранжевом.

(A) MK-5172, связанный с протеазой дикого типа с огибающей подложки в синем. Внутри- и межмолекулярные связи водородной связи отмечены красными и серыми пунктирными линиями. MK-5172 показан связанным с лекарственно-устойчивыми вариантами (B) R155K, (C) D168A и (D) A156T с прозрачными координатами, представляющими структуру дикого типа, чтобы лучше выделить молекулярные изменения каждой мутации. Во всех случаях каталитические остатки изображены желтым цветом, субстрат Р2 розовым и молекулы лекарственного средства в оранжевом.

В комплексах дикого типа, включающих макроциклические ингибиторы, R155 принял конформацию, отличную от тех, которые наблюдались в комплексах telaprevir и субстрата, чтобы обеспечить связывание расширенных фрагментов Р2 в субсайте S2. Эта конформация R155 стабилизируется взаимодействием водородной связи с участием D168 и D80. Конформация также наблюдалась для протеазы в комплексе с TMC435 и данопревиром, где большие фрагменты ингибиторов P2 расположены над боковой цепью гуанидина, что приводит к обширным взаимодействиям с катион-π [43], [45]. Ванипревир с изоиндолиновым фрагментом Р2 связан с конформацией, подобной данопревиру, что делает благоприятные взаимодействия с катион-π с R155, несмотря на макроцикл P2-P4. Напротив, MK5172 принял новую конформацию с хиноксалиновым фрагментом P2 с эфирным соединением, не взаимодействующим с R155 и D168, но вместо этого укладывается вместо H57 и D81 каталитической триады (рисунок 2). Таким образом, Р2-фрагменты этих трех макроциклов упаковываются в различные конформации вокруг активного сайта.

Для характеристики структур связывания лекарственных средств относительно натуральных субстратов анализировали комплексы лекарственного комплекса дикого типа по отношению к оболочке субстрата, консенсусный объем связывания субстратов [43] (фиг.3А-

6A). Ингибиторы, как правило, более уязвимы к сопротивлению, когда они выступают за пределы подложки и контактные остатки, менее существенные для распознавания и оборота субстрата. Все четыре препарата выступали из оболочки субстрата в субстанцию ​​протеазы S2 вблизи остатков R155, A156 и D168, которые индивидуально мутируют для обеспечения устойчивости к нескольким лекарственным средствам [37], [38], [44]. Телапревир с небольшим количеством циклопентилпролина Р2 делал меньше ван-дер-ваальсовых контактов с R155, A156 и D168 относительно данопревира и ванипревира, которые содержали карбаматсвязанные фрагменты изоиндолина Р2, которые выступали из подложки подложки и делали обширные ван-дер-ваальсовые контакты с эти остатки (фиг.3А-
5A). Изоиндолиновый фрагмент Данопревира, связанный в двух конформациях в комплексе дикого типа, но принимал одну конформацию в комплексах мутантов. Примечательно, что MK-5172 с эфиросодержащим хиноксалиновым фрагментом P2, выступая из оболочки подложки, укладывается на каталитическую триаду, избегая прямого контакта Ван-дер-Ваальса с R155 и D168 (фиг. 6A). Таким образом, хотя каждый из этих лекарств выступал из подложки подложки на подошве S2, каждый из них формировал уникальные взаимодействия с R155, A156 и D168. Таким образом, мутации у этих остатков дифференцированно влияли на связывание и активность лекарственного средства, что приводило к определенному профилю резистентности для каждого ингибитора.

Телапревир потерял потенцию против R155K по сравнению с протеазой дикого типа, хотя кристаллические структуры обоих комплексов были очень похожими, сохраняя ковалентную связь между кетоамидным фрагментом и каталитическим серином (рисунок 3B). R155K, однако, потерял взаимодействие с D168, тем самым нарушив электростатические сети, охватывающие R123, D168, R155 и D81, что важно для привязки telaprevir. Эти перестройки модулировали ландшафт заряда вдоль поверхности протеазы, нарушая взаимодействие с соседними фрагментами P2-циклопентилпролина и P4 циклогексилаланина telaprevir, что согласуется с предыдущими исследованиями в области моделирования [48]. Интересно, что telaprevir показал лучшую эффективность против варианта D168A, чем дикого типа; кристаллическая структура показала, что фрагмент Р2 сильно согнулся и упакован ближе к варианту D168A. Ингибитор смещался примерно на 0,5 Å относительно положения в комплексе дикого типа, что приводило к увеличению взаимодействия как с R155, так и с A156 (фиг. 3C, 7A). Однако мутация A156T привела к стерическому столкновению с фрагментом P2 telaprevir, что привело к значительному сдвигу ингибитора; группа ингибитора Р2 отошла от R155, потеряв взаимодействие Ван-дер-Ваальса с протеазой (рис. 3D, 7А). Примечательно, что в комплексе A156T-telaprevir ковалентная связь между кетоамидной боеголовкой и каталитическим серином была увеличена до более чем 2 Å, что свидетельствует о сниженной способности ковалентной модификации, что согласуется с большой потерей потенции против A156T (таблица 1). Таким образом, хотя гибкость telaprevir позволяет адаптироваться к D168A, он не может вместить нарушение R155K или A156T. Относительно слабая аффинность связывания telaprevir с протеазой дикого типа приводит к потенциально узкому диапазону, с помощью которого можно переносить устойчивые мутации.

Индексы контактной энергии Ван-дер-Ваальса для протеаз дикого типа и вариантов мутантов R155K, D168A и A156T показаны остатком протеазы для (A) telaprevir, (B) данопревира, (C) ванипревира и (D) MK-5172.

Как для данопревира, так и для ванипревира мутация R155K нарушала благоприятные катион-π-штабелирующие взаимодействия с фрагментами изоиндолина Р2 (рис. 4B), что приводило к значительному снижению активности лекарств (табл. 1). Мутация D168A также нарушала укладку фрагментов Р2 с R155, нарушая электростатическую сеть и, следовательно, положение R155 для оптимальной укладки катион-π. В данопревире фрагмент изоиндолина Р2 сдвигался в ответ на мутации R155K и D168A, что приводило к широкому взаимодействию с каталитическим D81 (фиг. 7B). Для ванипревира жесткость макроцикла P2-P4 предотвращала подобные компенсационные изменения (рис. 5C). Таким образом, D168A вызвал потери в эффективности данопревира и ванипревира, нарушив укладку катион-π. Однако гибкость P2-фрагмента данопревира несколько компенсирует эту потерю, объясняя большую эффективность данопревира по сравнению с вариантом D168A относительно ванипревира (таблица 1).

Мутация A156T стерически поражает связывание данопревира и ванипревира. В обоих комплексах с A156T Р2-фрагменты смещались в сторону каталитической триады и теряли взаимодействие катион-π с R155. Однако гибкость P2-фрагмента данопревира допускала больший сдвиг, что позволило получить более компенсационную упаковку против поверхности протеазы A156T (рис. 4D). Напротив, макроцикл P2-P4 ванипревира сдерживал способность Р2 и способность ингибитора учитывать эту стерическую нагрузку, более сильно компрометируя активность ванипревира. Таким образом, гибкая группа P2 данопревира позволила сохранить значительную эффективность по сравнению с вариантами A156T по сравнению с ванипревиром.

В отличие от комплексов данопревира и ванипревира с диким типом, в комплексе дикого типа МК-5172 хиноксалиновый фрагмент Р2 не складывался на R155 и меньше взаимодействовал с D168 и электростатической сетью с этими остатками. Таким образом, односайтовые мутации R155K и D168A вызвали очень незначительные изменения в конформациях связывания MK-5172 (фиг. 6B и 6C). Этот тонкий эффект отражается в небольшой потере потенции против варианта R155K (таблица 1); однако MK-5172 демонстрировал в 100 раз более низкую эффективность по сравнению с вариантом D168A, вероятно, из-за менее интенсивного взаимодействия с D81 и K136 относительно дикого типа и R155K (рисунок 7). A156T, худший из мутаций резистентности к MK-5172A, стерически связанный с макроциклом P2-P4 и вызвавший большой сдвиг в позиции связывания от каталитической триады относительно ее структуры дикого типа (рис. 6D). Это измененное связывание MK-5172 привело к уменьшению числа ван-дер-ваальсовых контактов с D81 и R155 и, вероятно, отвечает за 1000-кратное снижение активности по сравнению с вариантом A156T. В целом, анализ четырех кристаллических структур объясняет значительную сохранность MK-5172 в отношении R155K и D168A, а также потерю эффективности по сравнению с вариантом A156T из-за жесткости макроцикла (таблица 1).

Несмотря на захватывающий терапевтический успех ингибиторов протеазы NS3 / 4A, их долговременная эффективность оспаривается лекарственной устойчивостью. В этом исследовании мы объясняем молекулярную основу этой лекарственной устойчивости против четырех ингибиторов протеазы NS3 / 4A, telaprevir, danoprevir, vaniprevir и MK-5172, представляющих основные химические классы этих ингибиторов. Наш подробный анализ 16 кристаллических структур с высоким разрешением объясняет потерю активности ингибитора перед лицом мутаций резистентности. Это исследование поддерживает нашу модель оболочки субстрата, которая предусматривает, что ингибиторы уязвимы к резистентности, когда они контактируют с остатками протеазы за пределами области связывания субстрата и поэтому не являются существенными для связывания субстрата [43]. Эти сайты могут мутировать с минимальным воздействием на протеазную функцию и вирусную пригодность. Действительно, большинство резистентных мутаций происходят в регионах, где лекарственные средства выступают из оболочки субстрата, поскольку эти изменения селективно нарушают связывание лекарственного средства с минимальным воздействием на протеолиз субстрата.

Наиболее мощным ингибитором протеазы NS3 / 4A является MK-5172. Впервые мы сообщаем здесь новую связывающую конформацию для МК-5172, в которой хиноксалинная часть Р2 связывается вдали от субсайта S2 и вместо этого стекает против каталитических остатков H57 и D81. В отличие от других ингибиторов, MK5172 напрямую не взаимодействует с R155 и D168, которые мутируют, чтобы придать устойчивость к нескольким лекарственным средствам. Этот уникальный режим связывания MK-5172 объясняет его значительно большую эффективность по сравнению с вариантами R155K и D168A по сравнению с другими ингибиторами. MK-5172 обладает уникальным барьером для сопротивления, так как ни каталитический остаток (H57, D81) не может переносить мутацию. Эта связывающая конформация MK-5172 в сочетании с ее аффинностью к пикомолярному связыванию [27] (таблица 2), вероятно, позволит ей сохранить потенцию против широкого спектра устойчивых вирусных вариантов и генотипов.

Мы определяем структурную основу для дифференциальной активности лекарств против резистентных вариантов R155K, D168A и A156T для четырех основных химических классов ингибиторов протеазы NS3 / 4A. Телапревир уменьшил потенцию против R155K из-за потери контактов Ван-дер-Ваальса, но обладает лучшей эффективностью против D168A, поскольку он позволяет более плотную упаковку на субсайте S2. Мутации R155K и D168A подтверждают устойчивость данопревира и ванипревира, нарушая благоприятные взаимодействия с катион-π с R155. Интересно, что, хотя оба препарата теряют значительную активность против R155K, данопревир сохраняет более высокую активность против D168A. Это различие, вероятно, связано с гибкой изоиндолиновой частью P2 данопревира, которая не имеет циклизации P2-P4 и переупаковки по сравнению с вариантом D168A. Аналогичным образом, ванипревир и МК-5172 демонстрируют значительно меньшую эффективность против варианта A156T из-за прямых стерических столкновений, тогда как данопревир частично вмещает эту стерическую нагрузку, переупаковывая на мутированную поверхность. Таким образом, гибкость изоиндолинового фрагмента данопревира P2 позволяет ему сохранять активность против двух из трех основных лекарственно-устойчивых вариантов. Структурный анализ 16 комплексов ингибиторов протеазы определяет роль всех трех основных лекарственно-устойчивых мутаций.

Наши результаты также дают прогнозы активности препарата против других генотипов HCV и резистентных штаммов. Интересно отметить, что остатки NS3 / 4A вокруг активного сайта протеазы, включая R155, A156 и D168, являются высококонсервативными, за исключением генотипов 3 вирусов, которые содержат остатки Q168 и T123 вместо D168 и R123, обнаруженные в других генотипах (фиг. S2). Мы прогнозируем, что концевая амидная группа Q168 не сможет стабилизировать R155 для укладки против P2-фрагментов данопревира и ванипревира, но может взаимодействовать с T123. Таким образом, мы ожидаем, что данопревир и ванипревир проявят снижение потенции против вирусов генотипа 3, в то время как MK-5172 останется полностью активным. Действительно, недавно доказано, что данопревир и ванипревир обладают сниженной эффективностью против вирусов генотипа 3 [49]. Для штаммов генотипа 1 наши результаты показывают, что MK-5172 очень активен в отношении вариантов R155K и D168A, тогда как данопревир очень активен против варианта A156T и в меньшей степени против варианта D168A. Таким образом, по мере развития новых ингибиторов и тестирования резистентности к ВГС, наши результаты могут помочь разработать схемы лечения против ВГС для отдельных пациентов.

В целом наши результаты коррелируют с профилями резистентности, наблюдаемыми в клинических изолятах. Большинство ингибиторов протеазы выбирают для вариантов R155K у пациентов с генотипом 1a, поскольку требуется только одно нуклеотидное изменение [29], [30], [32], [37] — [42]. Вероятно, у пациентов с генотипом 1b есть более высокие барьеры для резистентности к R155K, требующие двух нуклеотидных замещений; таким образом, мутации на A156 и D168 более легко наблюдаются в ответ на лечение ингибитора протеазы. Сопротивление при R155K происходит из-за уменьшения взаимодействий на подсайте S2. Телапревир и другие линейные препараты кетоамида выбирают для вариантов A156T [39] — [41] путем прямых стерических столкновений, в то время как линейные (BI 201335) и макроциклические препараты (данопревир, ванипревир, TMC435) с большими фрагментами P2 выбирают для вариантов D168A [29], [30], [32], [42], нарушая благоприятные сочетания с R155. Эти данные также подтверждают обратное наблюдение, что варианты D168A являются необычными у пациентов, получавших терапир, поскольку препарат может упаковывать на субсайте S2. Аналогично, варианты A156T встречаются редко у пациентов, получающих макроциклические препараты, содержащие гибкие фрагменты Р2 из-за переливания лекарств против мутированной поверхности протеазы [29], [30], [32], [42]. Однако такие препараты, как ванипревир и МК-5172, содержащие Р2-Р4-циклизацию, скорее всего, выбирают для варианта А156Т из-за жесткости их Р2-фрагментов. Однако варианты A156T будут найдены в клинических изолятах, однако, зависит от дополнительных вирусных факторов, таких как относительные различия в вирусной пригодности между вариантами A156T и другими конкурирующими вирусными вариантами. Таким образом, наши данные обеспечивают уникальный ресурс для предвосхищающего прогнозирования резистентности и выбора наиболее подходящего ингибитора протеазы для лечения HCV в зависимости от профиля устойчивости конкретной вирусной популяции пациентов. Независимо от того, возникают ли специфические мутации в клинических изолятах, в конечном счете определяется сложное взаимодействие между эффективностью лекарственного средства, вирусной пригодностью и генетическими барьерами для резистентности. Таким образом, в зависимости от исходных вирусных видов будут существовать измененные пути к сопротивлению.

Кристаллические структуры этих ингибиторов NS3 / 4A также обеспечивают ключевой ресурс для руководства будущими стратегиями разработки лекарств. Высокая эффективность MK-5172, например, происходит от взаимодействия с основными остатками каталитических триад, которые не могут мутировать без серьезного нарушения вирусной пригодности. Кроме того, гибкие частицы Р2-препаратов, не содержащие макроциклов P2-P4, уменьшают потери в потенции до мутаций A156T и D168A. Подобные химические свойства могут быть включены в будущие препараты для потенциального уклонения от сопротивления. В частности, новые ингибиторы протеазы, которые включают в себя гибкие фрагменты Р2, такие как хиноксалиновые или подобные группы, могут использовать взаимодействия с основными каталитическими остатками и одновременно минимизировать контакт с субсайтом Р2, тем самым уменьшая их чувствительность к мутациям при R155, D168 и A156T. Таким образом, наши результаты показывают стратегии развития ингибиторов протеазы, которые сохраняют активность против более широкого спектра лекарственно-устойчивых вариантов HCV.

Данопревир, ванипревир и МК-5172 были синтезированы в домашних условиях после описанных методов; данопревир был приготовлен с использованием нашей конвергентной реакционной последовательности, как описано [43]; ванипревира и МК-5172, были получены после синтетических методов, описанных McCauley et al. [50] и Harper et al. [27], соответственно, с незначительными изменениями. Telaprevir был приобретен у A ChemTek, Inc. (Worcester, MA).

Гена генотипа HCV 1a NS3 / 4A-протеазы, описанного в патенте Bristol-Meyers Squibb [51], был синтезирован GenScript и клонирован в вектор экспрессии pET28a (Novagen). Эта высокорастворимая одноцепочечная конструкция генотипа 1a NS3 / 4A-протеазного домена содержит фрагмент кофактора NS4A, ковалентно связанный с N-концом [51]. Подобная протеазная конструкция демонстрировала каталитическую активность, сравнимую с таковой у подлинного полноразмерного белка [52]. Все варианты протеазы были сгенерированы с использованием набора мутагенеза на основе сайта QuikChange от Stratagene. Оптимизированная кодоном последовательность генотипа 1a геликазы (H77c) клонировали вниз по ходу до гена протеазы для генерации полноразмерной протеазной конструкции. Гениальный [53] использовался для генерации выравнивания последовательностей NS3 / 4A-протеазного домена из генотипов HCV 1-6.

Отдельные мутации (R155K, D168A или A156T) были введены в область NS3 генотипа 1a HCV Con1 luciferase репортерного репликона с использованием мега-праймерного метода мутагенеза [54]. Репликонную РНК каждого варианта протеазы вводили в клетки Huh7 путем электропорации. Затем репликацию оценивали в присутствии возрастающих концентраций ингибиторов протеазы (telaprevir, данопревира, ванипревира или МК-5172) путем измерения активности люциферазы (относительных легких единиц) через 96 часов после электропорации. Концентрации лекарственного средства, необходимые для ингибирования репликации репликона на 50% (IC50), рассчитывались непосредственно из кривых ингибирования лекарственного средства.

Для экспериментов по ингибированию фермента 5 нМ генотипа 1a HCV NS3 / 4A протеазного домена инкубировали с увеличением концентрации лекарственного средства в течение 15 минут (90 минут для telaprevir) в 50 мМ трис-аналитическом буфере (5% глицерина, 5 мМ TCEP, 6 мМ LDAO и 4% ДМСО, pH 7,5). Реакции протеолиза инициировали добавлением 100 нМ HCV NS3 / 4A субстрата [Ac-DE-Dap (QXL520) -EE-Abu-ψ- [COO] AS-C (5-FAMsp) -NH2] (AnaSpec) и контролировали с использованием Пластинчатый считыватель EnVision (Perkin Elmer) на длинах волн возбуждения и излучения 485 нм и 530 нм соответственно. Начальные скорости расщепления определяли по участкам кривых хода, соответствующих расщеплению субстрата менее 15%. Очевидные константы ингибирования (K
i) были получены путем нелинейного регрессионного подгонки к уравнению Начальной скорости и концентрации ингибитора Моррисона с использованием Prism 5 (GraphPad Software). Данные для каждого препарата генерировались в трех повторностях и обрабатывались независимо для расчета средней константы ингибирования и стандартного отклонения.

Выделение белка и очистку проводили, как описано [51], [55]. Вкратце, трансформированные клетки BL21 (DE3) E. coli выращивали при 37 ° С и индуцировали при оптической плотности 0,6 путем добавления 1 мМ IPTG. Клетки собирали после 5 часов экспрессии, гранулировали и замораживали при -80 ° C для хранения. Клеточные гранулы оттаивали, ресуспендировали в 5 мл / г буфера для повторного суспендирования (50 мМ фосфатного буфера, 500 мМ NaCl, 10% глицерина, 2 мМ-МЭ, рН 7,5) и лизировали клеточным разрушителем. Растворимую фракцию сохраняли, наносят на никелевую колонку (Qiagen), промывают буфером для повторного суспендирования и элюируют буфером для повторного суспендирования, дополненным 200 мМ имидазолом. Элюент диализовали в течение ночи (MWCO 10 кД) для удаления имидазола, а His-tag одновременно удаляли обработкой тромбином. Затем очищенный никелем белок замораживали и хранили при -80 ° С.

Вышеуказанный белковый раствор оттаивали, концентрировали до ~ 3 мг / мл и загружали на колонку HiLoad Superdex75 16/60, уравновешенную гель-фильтрующим буфером (25 мМ MES, 500 мМ NaCl, 10% глицерина, 30 мкМ хлорида цинка и 2 мМ DTT, pH 6,5). Фракции протеазы объединяли и концентрировали до 20-25 мг / мл с помощью устройства Amicon Ultra-15 10 кД (Millipore). Концентрированные образцы инкубировали в течение 1 часа с 1-3 мол рным избытком ингибитора. Кристаллы дифракционного качества получали в течение ночи путем смешивания равного объема концентрированного белкового раствора с осаждающим раствором (20-26% ПЭГ-3350, 0,1 М буфера натрия MES, 4% сульфата аммония, рН 6,5) в 24-луночных VDX-висячих капельках.

Данные рентгеновской дифракции были собраны в Advanced Photon Source LS-CAT 21-ID-F, GM / CA-CAT 23-ID-D или с собственной рентгеновской системой RAXIS IV. Интенсификация дифракции была проиндексирована, интегрирована и масштабирована с использованием программы HKL2000 [56]. Все структурные решения были получены с использованием простой изоморфной замены молекул PHASER [57]. В качестве исходной модели для всех структурных растворов использовалась модель B-цепи продукта вирусной подложки 4A4B (3M5M) [43]. Первоначальное уточнение проводилось в отсутствие смоделированного лиганда, который впоследствии был построен на поздних стадиях уточнения. Последующее кристаллографическое уточнение проводилось в программном пакете CCP4 с итеративными раундами TLS и сдержанной доработкой до достижения конвергенции [58]. Кристаллы белка протеазы дикого типа и резистентные к лекарственным средствам варианты R155K и D168A в комплексе с МК-5172 росли как псевдомероэдральные близнецы. Амплитудная двойниковая утонченность проводилась во время сдержанной утонченности для всех псевдомероэдральных близнецов. Окончательные структуры оценивали с помощью MolProbity [59] до осаждения в Банке данных о белках. Чтобы ограничить возможность отклонения модели во всем процессе уточнения, 5% данных были зарезервированы для расчета свободного R-значения [60]. Интерактивное построение модели и просмотр плотности электронов проводились с использованием программы COOT [61]. Fobs-Fcalc-лиганд не отображали карты с лигандом, исключенным из расчета фазы, используя программу PHENIX [62].

Суперпозиции проводили в PyMOL [63] с использованием атомов Cα остатков протеазы активного сайта 137-139 и 154-160. В качестве эталонной структуры для каждого выравнивания использовался комплекс дикого типа-данопревира. Охват вирусного субстрата NS3 / 4A рассчитывали, как описано, используя полноразмерную структуру NS3 / 4A (1CU1) [64] и комплексы продуктов 4A4B (3M5M), 4B5A (3M5N) и 5A5B (3M5O) [43].

Энергии контакта Ван-дер-Ваальса между остатками протеазы и продуктами пептидов были рассчитаны с использованием упрощенного потенциала Леннарда-Джонса, как описано [65]. Вкратце, потенциал Леннарда-Джонса (Vr) был рассчитан для каждой пары атомов протеазы-лекарственного средства, где r, ε и σ представляют собой межатомное расстояние, глубину глубины vdW и атомный диаметр соответственно:
Vr был рассчитан для всех возможных пар атомов протеаз-лекарство в пределах 5 Å, а потенциалы для несвязанных пар, разделенных меньшим расстоянием при минимальном потенциале, были приравнены к -ε.

Лиганд опускает карты для комплексов ингибиторов протеазы. Протеаза дикого типа NS3 / 4A (серый мультфильм) показана с ингибиторами (оранжевые палочки): (A) telaprevir, (B) данопревир, (C) ванипревир и (D) MK-5172. Карты плотности электронов (синий) изображают Fobs

Fcalc лиганд опускает карты, контурные в 1σ.

(TIF)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

Последовательное выравнивание протеазного домена NS3 / 4A для генотипов HCV 1-6. Консенсусная последовательность (1a M62321) протеазного домена NS3 / 4A показана серым цветом. Аминокислотные остатки в несогласии выделены цветом. Остатки в положениях 155 и 156 сохраняются в генотипах; однако генотип 3 показывает расхождение с консенсусом по аминокислоте 168.

(TIF)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

Связи с водородным связям лекарственных средств и контакты vdW с протеазой дикого типа.

(DOC)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

Мы благодарим Shivender Shandilya за создание пропущенных карт; Нукри Санишвили из лучевой линии GM / CA-CAT, Маркуса Бонна и Андрея Коростелева для сбора данных комплекса D168A-MK-5172; Дэвид Смит из лучевой линии LS-CAT для сбора данных всех других лекарственных комплексов; Герберт Клей, Мадхави Колли и Уильям Ройер за полезные обсуждения; Сима Миттал и Мадхави Налам за их вычислительную поддержку; и Nese Kurt Yilmaz за полезные изменения. Использование расширенного источника фотонов было поддержано Департаментом энергетики США, основными энергетическими науками, Управлением науки, по контракту № DE-AC02-06CH11357. Использование сектора LS-CAT 21 было поддержано Мичиганской корпорацией экономического развития и Мичиганским технологическим трехкорпусным коридором для поддержки этой исследовательской программы (грант 085P1000817). GM / CA-CAT финансируется полностью или частично за счет федеральных средств Национального института рака (Y1-CO-1020) и Национального института общих медицинских наук (Y1-GM-1104).

Алисия Ньютон, Кристос Дж. Петропулос и Вэй Хуан — сотрудники Monogram Biosciences. Примерно с 2008 по август 2010 года Селия Шиффер работала консультантом Monogram Biosciences по темам, не связанным с этим исследованием, и поэтому не имеет конкурирующего интереса. С момента завершения этого исследовательского проекта Селия Шиффер получила небольшие «спонсируемые исследовательские гранты» от Авила (CelGene) и Merck. Это не меняет нашу приверженность всем политикам PLoS Pathogens по обмену данными и материалами.

Эта работа была поддержана грантами Национального института здравоохранения R01-GM65347 и R01-AI085051. Финансисты не играли никакой роли в разработке исследований, сборе и анализе данных, решении опубликовать или подготовить рукопись.

Source: rupubmed.com

Читайте также



Источник: hepc.nextpharma.ru


Добавить комментарий